I. Abschnitt. Allgemeine Technik.

I. Die Einrichtung des Laboratoriums.

1. Instrumente.

Das Mikroskop. Aus eigener Erfahrung kenne ich die aus den optischen Werkstätten von Leitz in Wetzlar, Seibert in Wetzlar, R. Winkel in Göttingen und Zeiß in Jena hervorgegangenen Mikroskope, deren treffliche Leistungen ich schon vielfach erprobt habe. Es ist nicht ratsam, daß der Anfänger sich ein Mikroskop kaufe, ohne zuvor dasselbe einem Fachmanne zur Prüfung unterstellt zu haben; vor allem ist davor zu warnen, von Händlern Mikroskope zu erwerben, die den Aufdruck ganz unbekannter Firmen tragen. Zur guten Instandhaltung des Mikroskops ist es nötig, dasselbe vor Staub zu schützen; bei häufigem Gebrauch ist es am besten, das Mikroskop unter einer Glasglocke an einer dem Sonnenlichte nicht ausgesetzten Stelle aufzuheben. Der am Tubus sich bildende Schmutz wird mit einem trockene Stückchen weichen Filtrierpapiers abgerieben; Verunreinigungen der Linsen betreffen in der Regel nur die Oberfläche; der Anfänger hüte sich davor, die Linsen auseinander zu schrauben. Innere Trübungen können nur von sachkundiger Hand beseitigt werden. Linsen und Spiegel sind mit weichem Leder und, wenn das nicht zum Ziele führt (z. B. bei Beschmutzung mit Balsam), mit einem weichen Leinwandläppchen zu reinigen, welches mit einem Tropfen reinen Spiritus befeuchtet ist. Bei letzterer Prozedur sei man sehr vorsichtig, damit nicht etwa der Weingeist in die Fassung der Linsen eindringe und den Kanadabalsam auflöse, mit welchem die Linsen verkittet sind. Man wische deshalb schnell mit der befeuchteten Stelle des Läppchens den Schmutzfleck weg und trockne die Linse sorgfältig ab. Das bei Anwendung von Immersionslinsen haftende Zedernöl entferne man mit einem mit Benzin oder Xylol befeuchteten Leinwandläppchen; ebenso wird die Deckglasoberfläche der mit Immersionslinsen betrachteten Präparate gereinigt. Die Schrauben des Mikroskops sind mit Petroleum zu putzen.

Ein gutes Rasiermesser, dessen Klinge auf der einen Seite flach geschliffen ist. Das Messer ist immer scharf schneidend zu erhalten und muß vor jedesmaligem Gebrauche auf dem Streichriemen, ohne Druck auszuüben, abgezogen werden. Das Schleifen des Messers auf dem Steine ist dem Instrumentenmacher zu überlassen. Man benütze das Rasiermesser nur zum Anfertigen der feinen Schnitte.

Ein feiner Schleifstein.

Eine feine gerade Schere.

Eine feine, leicht schließende Pinzette mit glatten oder nur wenig gekerbten Spitzen.

Vier Nadeln mit Holzgriffen; zwei davon erhitze man, krümme sie dann leicht, erhitze sie abermals und steche sie in festes Paraffin, wodurch sie wieder gehärtet werden. Die beiden anderen müssen stets sauber und fein zugespitzt erhalten bleiben; bei feinen Isolierarbeiten spitze und poliere man die Nadeln erst auf dem Schleifsteine und dann auf dem Streichriemen. Sehr brauchbar sind die sogenannten Starnadeln der Augenärzte.

Nicht absolut notwendig, aber sehr brauchbar ist ein federnder Spatel aus Neusilber zum Übertragen der Schnitte aus Flüssigkeiten auf den Objektträger. Man kann statt dessen auch ein mit breiter Klinge versehenes Messer aus dem anatomischen Präparierbestecke benützen.

Stecknadeln, Igelstacheln, Korkplatten[10], ein feiner Malerpinsel.

Ein roter Kreidestift zum Schreiben auf Glas[11].

Objektträger (eines der gebräuchlichen Formate) sollen von reinem Glase und nicht zu dick (1-1,5 mm) und an den Kanten geschliffen sein; Deckgläschen von ca. 15 mm Seite sind für die meisten Fälle groß genug; ihre Dicke darf zwischen 0,1-0,2 mm schwanken; die an den Kanten grünlich schimmernden Deckgläschen sind den rein weißen, die sich mit der Zeit oft trüben, vorzuziehen.

Glasfläschchen (sogen. Pulverflaschen), ein Dutzend, mit weitem Halse von 30 und mehr ccm Inhalt. Fläschchen mit Glasstöpsel sind zu teuer und nicht zu empfehlen, da die Stöpsel meist schlecht eingerieben sind.

Einige größere Präparatengläser mit eingeschliffenem Glasdeckel, Höhe 8-10 cm, Durchmesser 6-10 cm; irdene Töpfe.

Ein graduiertes Zylinderglas, 100-150 ccm enthaltend. Ein Glastrichter von 8-10 cm oberem Durchmesser.

Eine Pipette; man kann sich kleine Pipetten selbst verfertigen, indem man sich ein ca. 1 cm dickes, ca. 10 cm langes Glasröhrchen in der Gasflamme an einem Ende spitz auszieht und am anderen Ende ein ca. 6 cm langes Stückchen Gummirohr aufsetzt, das am oberen Ende mit einem starken Bindfaden fest zugebunden wird.

Ein Dutzend Uhrgläser von ca. 5 cm Durchmesser.

Ein Dutzend Reagiergläschen von ca. 10 cm Länge und ca. 12 mm Weite.

Glasstäbe von ca. 3 mm Dicke, 15 cm Länge, z. T. an einem Ende spitz ausgezogen.

Für Reagenzien dienen alte Medizingläser, Weinflaschen usw., die man vorher gut gereinigt hat[12].

Nicht absolut nötig, aber sehr brauchbar sind Präparatenschalen mit Glasdeckel von 10-12 cm Durchmesser. Statt derselben lassen sich für viele Fälle Untertassen, Futternäpfchen für Vögel usw. verwenden.

Ein paar Bogen Filtrierpapier, große und kleine, gummierte Etiketten, weiche Leinwandlappen (alte Taschentücher), ein Handtuch, eine größere und eine kleinere Flaschenbürste.

Ein großer Steinguttopf für die Abfälle.

2. Reagenzien[13].

Allgemeine Regeln. Man halte sich nicht zu große Quantitäten vorrätig, da viele Reagenzien in verhältnismäßig kurzer Zeit verderben; einzelne Reagenzien (s. unten) sind erst kurz vor dem Gebrauch zu beziehen bzw. zuzubereiten. Jede Flasche muß mit einer großen, ihren Inhalt anzeigenden Etikette versehen sein; es empfiehlt sich, nicht nur das Rezept der betreffenden Flüssigkeit und das Herstellungsdatum, sondern auch die Art der Anwendung derselben auf der Etikette anzugeben. Sämtliche Flaschen müssen fest mit Kork oder mit guten Glasstöpseln verschlossen sein. Die Flüssigkeit soll nicht bis zur Unterfläche des Korkes reichen.

1. Destilliertes Wasser 3-6 l.

2. Kochsalzlösung: Für Untersuchung frischer Gewebe vom Frosch 0,65%ig, von Warmblütern 0,9%ig. Für feinere Beobachtungen ist statt der stets etwas schädigenden Kochsalzlösung die Ringersche Lösung zu empfehlen:

Kochsalz (NaCl) 0,9,

Kaliumchlorid (KCl) 0,02,

Kohlensaures Natron (NaHCO₃) 0,02,

Kalziumchlorid (CaCl₂) 0,02,

Aq. dest. 100,0.

Kochsalz- wie Ringerlösung sind nicht lange haltbar, deshalb am besten frisch angesetzt zu verwenden. Der Kork der Flasche wird zweckmäßig mit einem bis zum Flaschenboden reichenden Glasstab versehen.

3. Alkohol. a) Alkohol absolutus. 200 ccm vorrätig zu halten. Der käufliche absolute Alkohol ist ca. 98%ig und ist in den allermeisten Fällen für mikroskopische Zwecke vollkommen genügend. Will man vollständig wasserfreien Alkohol erhalten, so werfe man in die Flasche einige Stückchen (auf 100 ccm Alkohol je 15 g) weißgeglühten Kupfervitriols; ist letzterer blau geworden, so muß er durch neuen ersetzt oder von neuem gebrannt werden. Auch frisch gebrannter Kalk dient zu gleichem Zwecke, nur wirkt dieser langsamer.

b) Reiner Spiritus, ca. 90% Alkohol enthaltend, 3 bis 5 Liter („90%iger Alkohol“)[14].

c) 80%iger Alkohol. 500 ccm sind herzustellen durch Vermischen von 418 ccm 96%igem Alkohol mit 82 ccm destilliertem Wasser.

d) 70%iger Alkohol. 500 ccm sind herzustellen durch Vermischen von 365 ccm 96%igem Alkohol mit 135 ccm destilliertem Wasser.

e) 50%iger Alkohol. 500 ccm sind herzustellen durch Vermischen von 260 ccm 96%igem Alkohol mit 240 ccm destilliertem Wasser.

f) Ranviers Drittelalkohol. 35 ccm 96%iger Alkohol + 65 ccm destilliertes Wasser.

4. Essigsäure ca. 50 ccm. Die offizinelle Essigsäure ist 30%ig.

5. Eisessig (der in den Apotheken käufliche ist 96%ig) ist kurz vor dem Gebrauche zu beziehen (ca. 50 ccm). Gut verschlossen zu halten.

6. Salpetersäure. Man halte sich eine gutschließende Flasche mit 100 ccm konzentrierter Salpetersäure von 1,18 spez. Gewicht (enthält 32% Säurehydrat).

7. Reine Salzsäure von 1,124 spez. Gewicht, 50 ccm.

8. Formol. Die wässerige, 40%ige Formaldehydlösung kommt unter zwei Benennungen im Handel vor. a) Formol (Meister, Lucius & Brüning in Höchst am Main), b) Formalin (Chem. Fabrik auf Aktien, vormals Schering, Berlin). Formalin ist für mikroskopische Zwecke weniger empfohlen.

9. Chromsäure. Man bereite sich eine 10%ige Stammlösung (10 g der frisch bezogenen kristallisierten Chromsäure in 90 ccm destilliertem Wasser zu lösen). Davon bereite man sich a) 0,1%ige Chromsäurelösung (10 ccm der Stammlösung zu 990 ccm destilliertem Wasser) und

b) 0,5%ige Chromsäurelösung (50 ccm der Stammlösung zu 950 ccm destilliertem Wasser).

10. Doppelt chromsaures Kali. Man halte vorrätig:

a) 3%ige Lösung; 30 g in 1000 ccm destilliertem Wasser.

b) 3¹/₂%ige Lösung; 35 g in 1000 ccm destilliertem Wasser gelöst, für Kalibichromat-Formol (12.) und für die Golgische Mischung (16.).

c) 5%ige Lösung; 5 g in 100 ccm destilliertem Wasser, gelöst für Altmannsche Mischung.

Die Lösung erfolgt bei Zimmertemperatur langsam (in 3 bis 6 Tagen). Man bereite deshalb die Lösung mit erwärmtem Wasser oder stelle die Flasche in die Nähe des Ofens.

11. Kalibichromat-Essigsäure nach Tellyesnizcky, kurz vor dem Gebrauch anzufertigen, indem man zu je 100 ccm der 3%igen Lösung (Nr. 10a) 5 ccm Eisessig zusetzt.

12. Kalibichromat-Formol nach Kopsch, kurz vor dem Gebrauch anzufertigen, indem man zu 80 ccm der 3¹/₂%igen Lösung (Nr. 10b) 20 ccm Formol (8) zusetzt.

13. Müllersche Flüssigkeit. 30 g schwefelsaures Natron und 60 g pulverisiertes doppeltchromsaures Kali werden in 3000 ccm destilliertem, vorher aufgekochtem Wasser gelöst. Die Lösung kann wie 10 warm bereitet werden.

14. Müller-Formol (Orthsches Gemisch) 10 ccm Formol (8) zu 100 ccm Müllerscher Flüssigkeit; jedesmal direkt vor dem Gebrauch zuzubereiten.

15. Zenkersche Flüssigkeit. 25 g Kali bichromic. 10 g Natrium sulfuricum und 50 g Sublimat werden in 1000 ccm destilliertem, warmem Wasser gelöst. Vor dem Gebrauch ist zu je 20 ccm dieser Mischung 1 ccm Eisessig oder 1-2 ccm Formol zuzufügen.

16. Golgische Mischung (Osmio-bichromische Mischung) wird bereitet durch Zusammengießen von 54 ccm der 3,5%igen Lösung von doppeltchromsaurem Kali (10b) und 6 ccm der 2%igen Osmiumlösung (21). Kurz vor dem Gebrauch herzustellen.

17. Natriumthiosulfat (unterschwefligsaures Natrium) 2,5 g zu 100 ccm destilliertem Wasser. Das Salz verwittert an der Luft.

18. Eisenlösung. Es werden 2,5 g schwefelsaures Eisenammonoxyd [(NH₄)₂Fe₂(SO₄)₄] in 100 ccm destilliertem Wasser gelöst.

19. Pikrinsäure. Man halte vorrätig 50 g der Kristalle und ca. 500 ccm einer gesättigten, wässerigen Lösung, in welcher die Kristalle immer in 2 bis 3 mm hoher Schicht am Boden der Flasche liegen müssen. Löst sich leicht.

20. Chrom-Essigsäure. Zu 50 ccm 0,5%iger Chromsäurelösung (9b.) werden 50 ccm destilliertes Wasser und 3-5 Tropfen Eisessig gesetzt.

21. Osmiumsäure. 50 ccm der 2%igen wässerigen Lösung vor dem Gebrauche aus der Apotheke zu beziehen. (Sehr teuer.) Ist, wenn in gut gereinigtem Glase gelöst und gut verschlossen, viele Monate haltbar.

22. Chromosmium-Essigsäure nach Flemming. Man bereite sich eine 1%ige Chromsäurelösung (5 ccm der 10%igen Lösung S. 5 zu 45 ccm destilliertem Wasser), gieße dazu 12 ccm der 2%igen Osmiumsäure, und füge noch 3 ccm Eisessig hinzu. Diese Mischung muß nicht im Dunkeln aufbewahrt und kann lange vorrätig gehalten werden[15].

23. Gesättigte Sublimatkochsalzlösung. 7,5 g Kochsalz werden zu einem Liter destilliertem Wasser gefügt, nach der Lösung 125 g Sublimatkristalle zugesetzt, die sich erst unter Erwärmen lösen. Die warme Lösung ist zu filtrieren. Nach dem Erkalten bilden sich am Boden der Flasche weiße Kristallnadeln.

24. Salpetersaures Silberoxyd. Man beziehe kurz vor dem Gebrauch aus der Apotheke eine Lösung von 1 g Argent. nitric. in 100 ccm destilliertem Wasser. Die Flüssigkeit muß im Dunkeln oder in schwarzer Flasche aufbewahrt werden und ist lange haltbar.

25. Ammoniakalische Silberlösung muß jedesmal direkt vor dem Gebrauche frisch bereitet werden.

a) 10%ige wässerige Lösung von Argent. nitric. 10 ccm werden in eine kleine Kochflasche gegossen.

b) 40%ige Natronlösung wird mit einer Pipette tropfenweise zugesetzt; nach jedem Tropfen, bei dem sich ein Niederschlag bildet, ist die Kochflasche ein wenig zu schütteln. Bildet sich bei dem Zusatz eines Tropfens kein neuer Niederschlag mehr — der alte Niederschlag löst sich nicht auf — so hört man mit weiterem Zusatz auf. Man braucht im ganzen kaum 1 ccm Natronlösung.

c) 10%ige Ammoniaklösung wird tropfenweise zugesetzt, nach jedem Zusatz wird die Mischung geschüttelt. Dadurch löst sich der Niederschlag bis auf ein paar Körnchen. Zuviel Ammoniak verdirbt alles; es sind im ganzen 6-7 ccm zur Mischung zuzusetzen.

d) Die Mischung wird durch einen kleinen Filter in ein graduiertes Zylinderglas gegossen, es ergeben sich ca. 18 ccm Flüssigkeit, zu der das 4fache Quantum, also 72 ccm destilliertes Wasser zugegossen werden.

26. Sublimatpikrinsäure. Gleiche Teile der Lösung Nr. 19 und 23.

27. Goldchlorid. Man beziehe kurz vor dem Gebrauche aus der Apotheke eine Lösung von 1 g Aur. chlorat. in 100 ccm destilliertem Wasser. Im Dunkeln oder in schwarzer (brauner) Flasche zu halten.

Zur Goldchloridfärbung bedarf man

28. Ameisensäure. 50 ccm.

29. Konzentrierte (35%ige) Kalilauge 30 ccm. Das Fläschchen muß mit einem nicht vulkanisierten Kautschukpfropfen, der von einem Glasstabe durchzogen ist, verschlossen sein. Aus der Apotheke zu beziehen.

30. Glyzerin. 100 ccm reines Glyzerin vorrätig zu halten, sowie eine Lösung von 5 ccm reinem Glyzerin in 25 ccm destilliertem Wasser. Zur Verhütung der rasch in diesem Gemisch auftretenden Pilze kann man 5-10 Tropfen reine 1%ige Karbolsäurelösung oder einen Chloralhydrat-Kristall zusetzen. Der Kork des Fläschchens muß mit einem Glasstabe versehen sein.

31. Xylol ist wegen seiner Empfindlichkeit gegen unvollständig entwässerte Präparate Anfängern weniger zu empfehlen als

32. Karbol-Xylol, das hergestellt wird durch Zusatz von 22 g kristall. Karbolsäure zu 100 ccm Xylol; auch nicht völlig wasserfreie Schnitte lassen sich durch Karbolxylol aufhellen.

33. Xylolbalsam, Lösung von Kanadabalsam in Xylol; am besten ist der von Merk in Darmstadt oder der von Dr. K. Hollborn in Leipzig käufliche Balsam. Der Kork der Flasche muß mit einem Glasstabe versehen sein.

34. Deckglaskitt. Venetianisches Terpentin wird mit so viel Schwefeläther verdünnt, bis das Ganze eine leicht tropfbare Flüssigkeit bildet; dann wird warm filtriert (im heizbaren Trichter) und das Filtrat auf dem Sandbade eingedickt. Die richtige Konsistenz ist erreicht, wenn ein mit einem Glasstabe auf den Objektträger übertragener Tropfen sofort soweit erstarrt, daß er ganz hart wird und sich mit dem Fingernagel nicht mehr eindrücken läßt. Man lasse wegen Feuersgefahr den Kitt in der Apotheke anfertigen.

35. Hämatoxylin nach Hansen. a) 1 g kristallisiertes Hämatoxylin wird in 10 ccm absolutem Alkohol gelöst und in geschlossener Flasche aufbewahrt, b) 20 g Kalialaun werden in 200 ccm destilliertem Wasser warm gelöst und nach dem Erkalten filtriert, c) 1 g übermangansaures Kali wird in 16 ccm destilliertem Wasser bei Zimmertemperatur gelöst. Am nächsten Tage werden Lösungen a) und b) in eine Porzellanschale zusammengegossen, mit 3 ccm der Lösung c) vermischt und unter stetem Umrühren bis zum Sieden erhitzt (man lasse ca. 1 Minute lang sieden). Dann kühle man rasch ab, indem man die Porzellanschale auf kaltem Wasser schwimmen läßt. Nach dem Erkalten wird die Mischung filtriert und ist von da ab verwendbar. Trübungen, Pilzentwicklung in der Flüssigkeit beeinträchtigen die Leistungsfähigkeit derselben nicht im mindesten. Vorrätig zu halten.

36. Hämatoxylin nach Delafield. a) 1 g kristallisiertes Hämatoxylin wird in 6 ccm Alk. absol. gelöst. b) 15 g Ammoniakalaun werden in 100 ccm destilliertem Wasser warm gelöst und nach dem Erkalten filtriert. Dann werden beide Lösungen zusammengegossen, die Mischung bleibt drei Tage in weit offenem Gefäß am Lichte stehen, wird dann filtriert und vermischt mit 25 ccm reinem Glyzerin und 25 ccm Methylalkohol. Nach drei Tagen wird die Mischung filtriert und ist — lange haltbar — vorrätig zu halten.

37. Hämatoxylin nach Weigert zur Darstellung der markhaltigen Nervenfasern des Gehirnes und Rückenmarkes. 1 g kristallisiertes Hämatoxylin wird in 10 ccm Alkohol abs. + 90 ccm destilliertes Wasser gebracht, gekocht und nach dem Erkalten filtriert.

Die Anwendung dieser Farbe beansprucht die Zuhilfenahme einer

38. Gesättigten Lösung von neutralem essigsaurem Kupferoxyd, 10 g Cupr. acet. cryst. neutr. in 100 ccm destilliertem Wasser gelöst; lange haltbar. Ferner einer

39. Blutlaugensalz-Boraxlösung; 2 g Borax und 2,5 g Ferrizyankalium zu 100 ccm destilliertem Wasser: lange haltbar.

40. Pikrokarmin. Man gieße zu 50 ccm destilliertem Wasser 5 ccm Liq. ammon. caustic., schütte in diese Mischung 1 g besten Karmin. Umrühren mit dem Glasstabe. Nach vollendeter Lösung des Karmins (etwa 5 Minuten) gieße man 50 ccm gesättigte Pikrinsäurelösung zu und lasse das Ganze zwei Tage in weit offenem Glase stehen. Dann filtriere man. Selbst reichliche Pilzentwicklung beeinträchtigt nicht die Färbekraft dieses vorzüglichen, in seiner Wirkung auf fixierte Präparate aber ungleich wirkenden Mittels. Für Färbung unter dem Deckglase (§ 11) am meisten zu empfehlen.

41. Alaunkarmin. 5 g Alaun werden in 100 ccm warmem, destilliertem Wasser aufgelöst und dann 2 g Karmin zugefügt. Diese Mischung wird 10-20 Minuten gekocht und nach dem Erkalten filtriert; zuletzt werden der klaren, schön rubinroten Flüssigkeit 2-3 Tropfen Acid. carbol. liquefact.[16] zugesetzt. Noch besser färbt

42. Boraxkarmin. 4 g Borax werden in 100 ccm warmem destilliertem Wasser aufgelöst, nach dem Erkalten der Lösung werden 3 g guter Karmin unter Umrühren zugefügt und dann 100 ccm 70%iger Alkohol (siehe S. 4) zugegossen. Nach 24 Stunden filtriere man die Flüssigkeit, die sehr langsam (24 Stunden und noch länger) durch das Filter tropft.

Die Boraxkarminfärbung beansprucht die Nachbehandlung mit 70%igem salzsaurem Alkohol, welcher durch Zufügen von 4-6 Tropfen reiner Salzsäure zu 100 ccm 70%igem (S. 4) Alkohol bereitet wird.

43. Parakarmin. 4 g Karminsäure (Grübler), ¹/₂ g Chloraluminium, 4 g Chlorkalzium werden in 100 ccm 70%igem Alkohol gelöst. Lange haltbar.

44. Karminsaures Natron. 2 g des Farbstoffes in 200 ccm destilliertem Wasser zu lösen.

45. Saffranin. 2 g des Farbstoffes in 60 ccm 50%igem Alkohol (31 ccm 96%iger Alkohol + 29 ccm destilliertes Wasser) zu lösen. Vorrätig zu halten.

46. Eosin. 1 g des Farbstoffes in 60 ccm 50%igem Alkohol (31 ccm 96%iger Alkohol + 29 ccm destilliertes Wasser) zu lösen. Vorrätig zu halten.

47. Orange. 1 g des Farbstoffes in 60 ccm 50%igem Alkohol zu lösen.

48. Kongorot. 1 g des Farbstoffes wird in 100 ccm destilliertem Wasser gelöst. Von dieser Stammlösung stelle man sich her:

Eine ¹/₃₀%ige Lösung: 3 ccm Stammlösung zu 100 ccm Aq. destill.

49. Vesuvin oder

50. Methylviolett B. und andere basische Anilinfarbstoffe können in gesättigten wässerigen Lösungen (1 g zu 50 ccm destilliertem Wasser) vorrätig gehalten werden.

51. Methylenblau. 1 g in 100 ccm destilliertem Wasser gelöst, ist ebenso wie das zur Nachbehandlung gehörige

52. Molybdänsaures Ammonium, 7 g zu 93 ccm destilliertem Wasser, lange haltbar.

53. Säurefuchsin (= Rubin S). 1 g des Farbstoffes in 100 ccm destilliertem Wasser gelöst.

54. van Giesons Pikrofuchsin. Zu 10 ccm der 1%igen Säurefuchsinlösung (53) werden 100 ccm gesättigter wässeriger Pikrinsäurelösung (19, S. 6) gegossen.

55. Bleu de Lyon Stammlösung. 1 g in 100 ccm absol. Alkohol gelöst.

56. Resorcin-Fuchsin nach Weigert (Modifikation Pranter). 0,02 g des trocken von Hollborn (S. 3) zu beziehenden Farbstoffes werden in 1 g (nicht Volumteil) konz. Salpetersäure und 100 g 70%igem Alkohol gelöst. Kurz vor dem Gebrauche zu bereiten.

57. Alaunkarmin-Dahlia nach Westphal. Man löse 1 g Dahlia in 25 ccm Alcohol absol., setze 12 ccm reines Glyzerin und 5 ccm Eisessig zu und gieße zu dieser Mischung 25 ccm Alaunkarmin (41, S. 8). In gut schließender Flasche aufzubewahren.

58. Methylblau. 1 g in 100 ccm destilliertem Wasser gelöst (gut haltbar).

59. Phosphormolybdänsäure; als 2%ige Lösung in der Apotheke zu beziehen.

Weitere zu Spezialfärbungen notwendige Reagenzien s. unter Spezielle Technik.

II. Das Herstellen der Präparate.

Einleitung.

Die wenigsten Organe des tierischen Körpers sind so beschaffen, daß sie ohne weiteres der mikroskopischen Untersuchung zugänglich sind. Sie müssen einen gewissen Grad von Durchsichtigkeit besitzen, den wir dadurch erreichen, daß wir die Organe entweder in ihre Elemente zerteilen, die Elemente isolieren, oder in dünne Schnitte zerlegen, schneiden. Nun haben aber wiederum die wenigsten Organe eine Konsistenz, welche sofortiges Anfertigen genügend feiner Schnitte gestattet; sie sind entweder zu weich, dann muß man sie härten, oder zu hart (verkalkt), dann muß man sie entkalken. Härten und Entkalken kann jedoch nicht an frischen Objekten vorgenommen werden, ohne deren Struktur zu schädigen; es muß demnach beiden Prozeduren ein Verfahren vorausgehen, welches eine rasche Erstarrung und damit eine Festigung der kleinsten Teilchen ermöglicht; dieses Verfahren nennt man fixieren. Das Anfertigen feiner Schnitte ist demnach meist nur nach vorausgegangener Fixierung und Härtung (eventuell nachfolgender Entkalkung) des betreffenden Objektes möglich. Aber auch die Schnitte beanspruchen noch weitere Behandlung; sie können entweder sofort durchsichtig gemacht werden, durch Aufhellungsmittel, welche auch mit Erfolg bei frisch untersuchten Objekten angewendet werden, oder sie können vor der Aufhellung gefärbt werden. Die Farbstoffe sind für die mikroskopische Untersuchung unschätzbare Hilfsmittel; sie lassen sich auch auf frische, ja selbst auf lebende Organe applizieren; eine große Zahl der wichtigsten Tatsachen ist nur mit Hilfe der Farbstoffe aufgedeckt worden. In die Gefäße eingespritzt, injiziert, lehren sie uns die Verteilung und den Verlauf der feinsten Verzweigungen derselben kennen.

§ 1. Beschaffenheit des Materials.

Für Studien über die Formelemente und die einfachsten Gewebe sind Amphibien: Frösche, Molche (am besten der gefleckte Salamander, dessen Elemente sehr groß sind) zu empfehlen, für Studien der Organe dagegen nehme man Säugetiere. Für viele Fälle genügen hier unsere Nagetiere (Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte, Maus), ferner junge Hunde, Katzen usw. Doch versäume man keine Gelegenheit, die Organe des Menschen sich zu verschaffen. Vollständig frisches Material ist in chirurgischen Kliniken zu haben; im Winter sind viele Teile selbst vor 2-3 Tagen Verstorbener noch brauchbar.

Im allgemeinen empfiehlt es sich, die Organe lebenswarm einzulegen. Um möglichst rasch dieser Aufgabe sich zu entledigen, ist es geboten, zuerst die zur Aufnahme der Objekte bestimmten Gläser mit der betreffenden Flüssigkeit zu füllen und mit einer Objekt, Flüssigkeit und Datum (eventuell Stunde) anzeigenden Etikette zu versehen; danach lege man die zur Sektion nötigen Instrumente (das anatomische Präparierbesteck) zurecht und dann erst töte man das Tier. Dem lebenden Tiere Teile zu entnehmen, ist eine nutzlose Grausamkeit.

§ 2. Töten und Sezieren der Tiere.

Amphibien durchschneide man mit einer starken Schere die Halswirbelsäule und zerstöre Hirn und Rückenmark vermittelst einer von der Wunde aus in die Schädelhöhle bzw. in den Wirbelkanal eingestoßenen Nadel. Säugetieren durchschneide man den Hals mit einem kräftigen, bis zur Halswirbelsäule reichenden Schnitt oder man töte sie mit Chloroform, das man auf ein Tuch gießt und so den Tieren vor die Nase drückt. Kleine, bis 4 cm große Tiere, Embryonen, können im ganzen in die Fixierungsflüssigkeit geworfen werden. Nach ca. 6 Stunden öffne man diesen die Bauch- und Brusthöhle durch Einschnitte. Bei der Sektion halte womöglich ein Gehilfe die Extremitäten; kleine Tiere kann man mit starken Stecknadeln an den Fußflächen auf Kork- oder Wachsplatten spannen. Die Organe müssen sauber herauspräpariert werden (am besten mit Pinzette und Schere), Quetschen und Drücken der Teile, Anfassen mit den Fingern ist vollkommen zu vermeiden. Die Pinzette darf nur am Rande der Objekte eingreifen; anhängende Verunreinigungen, Schleim, Blut, Darminhalt dürfen nicht mit dem Skalpell abgekratzt werden, sondern sind durch langsames Schwenken in der betreffenden Fixationsflüssigkeit oder in Ringerscher Lösung (s. S. 4) zu entfernen.

Methoden.

Bei den im folgenden angegebenen Methoden ist es nicht zu vermeiden, daß Scheren, Pinzetten, Nadeln, Glasstäbe usw. mit den verschiedensten Flüssigkeiten, z. B. Säuren, benetzt werden. Man reinige die Instrumente sofort nach dem Gebrauche durch Abspülen in Wasser und Abtrocknen. Vor allem vermeide man, einen z. B. mit einer Säure oder mit einem Farbstoff benetzten Glasstab in eine andere Flüssigkeit zu tauchen. Abgesehen davon, daß die Reagenzien dadurch verdorben werden, wird oft das Gelingen der Präparate hierdurch gänzlich vereitelt. Gläser, Uhrschalen usw. sind leicht zu reinigen, wenn dies sofort nach der Benützung geschieht; läßt man dagegen z. B. einen Farbstoffrest in einem Glase antrocknen, so ist das Reinigen immer sehr zeitraubend. Man versäume also nie, auch die Gläser sofort nach dem Gebrauche zu reinigen; Uhrschalen werfe man wenigstens in eine Schüssel mit Wasser.

Alle Gefäße, in denen man isoliert, fixiert, härtet, färbt usw., müssen geschlossen gehalten (Uhrschalen decke man mit einer zweiten Uhrschale zu, wenn die Manipulationsdauer 10 Minuten übersteigt), und dürfen nicht in die Sonne gestellt werden.

§ 3. Isolieren.

Man isoliert entweder durch Zerzupfen der frischen Objekte oder nach vorhergehender Behandlung der Objekte mit lösenden Flüssigkeiten, welche ein Zerzupfen ganz oder teilweise unnötig machen. Es gehört zu den schwierigen Aufgaben, ein gutes Zupfpräparat anzufertigen. Viel Geduld und genaue Erfüllung nachstehender Vorschriften sind unerläßlich. Die Nadeln müssen spitz und ganz rein sein; man spitze und poliere sie zuvor auf dem angefeuchteten Schleifsteine. Das kleine Objekt, von höchstens 4 mm Seite, wird nun in einen kleinen Tropfen auf den Objektträger gelegt, und wird, wenn es farblos ist, auf schwarzer, wenn es dunkel (etwa gefärbt) ist, auf weißer Unterlage zerzupft. Ist das Objekt faserig (z. B. ein Muskelfaserbündel), so setze man beide Nadeln an dem einen Ende des Bündels an und zerreiße dasselbe der Länge nach in zwei Bündel; das eine dieser Bündel wird auf dieselbe Weise, immer durch Ansetzen der Nadel an das Ende, wieder in zwei Bündel getrennt und so fort, bis ganz feine einzelne Fasern erzielt sind. Durch Betrachtung des (unbedeckten) Präparates mit schwacher Vergrößerung kann man kontrollieren, ob der nötige Grad von Feinheit erreicht ist.

In wenig Flüssigkeit liegende, nicht mit einem Deckglase bedeckte Präparate sehen oft unklar aus, zeigen schwarze Ränder usw., Fehler, die durch Zusatz eines hinreichend großen Tropfens und durch ein Deckglas wieder ausgeglichen werden.

Als isolierende Flüssigkeiten sind zu empfehlen:

a) Für Epithelzellen

ist Ranviers Drittelalkohol (s. S. 4) ein ausgezeichnetes Isolationsmittel. Man lege Stückchen von 5-10 mm Seite (z. B. der Darmschleimhaut) in ein relativ geringes Quantum (ca. 10 ccm) dieser Flüssigkeit ein. Nach 5 Stunden (bei geschichtetem Pflasterepithel nach 10-24 Stunden und später) werden die Stückchen mit einer Pinzette vorsichtig, langsam herausgehoben und ein paar Mal leicht auf einen Objektträger aufgestoßen, der mit einem Tropfen der gleichen Flüssigkeit bedeckt ist. Durch das Aufstoßen fallen viele Epithelzellen isoliert ab, manchmal ganze Fetzen, die man nur mit der Nadel leicht umzurühren braucht, um eine vollkommene Isolation zu erzielen. Nun lege man ein Deckglas auf (S. 44) und untersuche. Will man das Objekt färben, so bringe man die ganzen Stückchen vorsichtig aus dem Alkohol in ca. 6 ccm Pikrokarmin (S. 8). Nach 2-4 Stunden wird das Stückchen sehr vorsichtig in ca. 5 ccm destilliertes Wasser gelegt und nach fünf Minuten auf den Objektträger aufgestoßen, der diesmal mit einem Tropfen verdünnten Glyzerins (30, S. 7) bedeckt ist. Deckglas. Das Präparat kann konserviert werden.

b) Für Muskelfasern, Drüsen

eignet sich 35%ige Kalilauge (s. S. 7). Stückchen von 10-20 mm Seite werden in 10-20 ccm dieser Flüssigkeit eingelegt; nach etwa einer Stunde sind die Stückchen in ihre Elemente zerfallen, die mit Nadeln oder einer Pipette herausgefischt und in einem Tropfen der gleichen Kalilauge unter Deckglas betrachtet werden. Jedes Hervorquellen der Kalilauge unter dem Deckglas ist streng zu vermeiden, da die Metallfassung des Objektives dadurch in Gefahr kommt! Verdünnte Kalilauge wirkt ganz anders; würde man die Elemente in einem Tropfen Wasser betrachten wollen, so würden dieselben durch die nunmehr verdünnte Lauge in kürzester Zeit zerstört werden. Gelingt die Isolation nicht (statt dessen tritt zuweilen eine breiige Erweichung der Stückchen ein), so ist die Kalilauge zu alt gewesen. Man wende deshalb stets frisch bezogene Lösungen an. Auch die gelungenen Präparate lassen sich nicht konservieren.

Ferner ist geeignet eine Mischung von chlorsaurem Kali und Salpetersäure. Man bereite sich dieselbe, indem man in 20 ccm reine Salpetersäure (S. 5) so viel chlorsaures Kali (ca. 5 g) wirft, daß ein ungelöster Satz am Boden bleibt. Nach 1-6 Stunden (manchmal später) ist das Objekt genügend gelockert und wird nun in 20 ccm destilliertes Wasser übertragen, in dem es eine Stunde bleibt, aber ohne Schaden auch 8 Tage verweilen kann. Dann wird es auf den Objektträger übertragen, wo es in einem Tropfen dünnen Glyzerins (30, S. 7) mit Leichtigkeit zerzupft werden kann. Wenn die Salpetersäure gut ausgewaschen ist, lassen sich die Präparate konservieren und auch unter dem Deckglase färben (S. 47). Einlegen der noch nicht zerzupften Stückchen in Pikrokarmin (s. die Isolation von Epithelzellen) gelingt nicht, da diese Farbflüssigkeit die Objekte brüchig macht.

c) Für Drüsenkanälchen

ist vorzüglich das Einlegen kleiner Stücke (von ca. 1 cm Seite) in 10 ccm reine Salzsäure. Nach 10-20 Stunden werden die Stückchen in ca. 30 ccm destilliertes Wasser gebracht, das innerhalb 24 Stunden mehrmals gewechselt werden muß. Die Isolation gelingt dann leicht durch vorsichtiges Ausbreiten des Stückchens mit Nadeln in einem Tropfen verdünntem Glyzerin. Die so hergestellten Präparate können konserviert werden.

§ 4. Fixieren.

Allgemeine Regeln. 1. Zum Fixieren muß stets reichliche, das Volum des zu fixierenden Objektes 50-100mal übertreffende Flüssigkeit verwendet werden. 2. Die Flüssigkeit muß stets klar sein, sie muß, sobald sie trübe geworden ist, gewechselt, d. h. durch frische Flüssigkeit ersetzt werden. Die Trübung tritt oft schon eine Stunde (oder früher) nach dem Einlegen ein. 3. Die zu fixierenden Objekte sollen möglichst klein sein, im allgemeinen 1-2 ccm nicht überschreiten. Das Zerkleinern der Stücke geschieht mit scharfem Rasiermesser unter möglichster Vermeidung von Druck, bei weichen Organen erst eine oder mehrere Stunden nach dem Einlegen in die Fixierungsflüssigkeit, wenn die Stücke schon etwas fester geworden sind.

Sollte die Erhaltung des ganzen Objektes nötig sein (z. B. zur nachherigen Orientierung), so mache man wenigstens viele tiefe Einschnitte (5-10 Stunden nach dem ersten Einlegen) in dasselbe. Die Objekte sollen nicht am Boden liegen, man hänge sie entweder im Glase auf oder man bringe auf den Boden des Gefäßes eine mehrere Zentimeter hohe Lage entfetteter Watte oder Glaswolle; dadurch wird erreicht, daß die im Objekt enthaltene Flüssigkeit zu Boden sinkt und die Fixierungsflüssigkeit rasch und in voller Konzentration eindringt. Bei Warmblütern ist zu empfehlen das halbstündige Einlegen in erwärmte (auf 39° C) Fixierungsflüssigkeit. Kleine und zarte Objekte (z. B. Embryonen — 3 mm Länge) werden nur kürzere Zeit, z. B. in Zenker (S. 16) nur eine Stunde fixiert.

1. Alkohol absolutus ist für Drüsen, Haut, Blutgefäße usw. sehr geeignet. Er wirkt zugleich als Härtungsmittel. In absolutem Alkohol eingelegte Objekte können schon nach 24 Stunden geschnitten werden.

Man schiebe die Verarbeitung der in absolutem Alkohol fixierten Objekte nicht zu lange Zeit hinaus, da die Elemente doch allmählich leiden; man schneide nach 3-5 Tagen. Will man die Objekte noch weiter aufheben, so bringe man sie von da ab in 90%igen Alkohol. Schnitte von Objekten, die nur 24 Stunden in absolutem Alkohol gelegen hatten, färben sich zuweilen schlecht.

Er eignet sich vorzugsweise zur raschen Herstellung von Präparaten. Besonders zu beachten ist folgendes: 1. Der absolute Alkohol muß, auch wenn er nicht getrübt ist, nach 3-4 Stunden gewechselt werden. 2. Man vermeide, daß die eingelegten Objekte auf dem Boden des Glases fest aufliegen oder gar festkleben: man hänge deshalb die Objekte entweder an einem Faden im Alkohol auf, oder lege auf den Boden des Glases ein Bäuschchen Watte.

Nicht absoluter (z. B. 90%iger) Alkohol wirkt ganz anders, schrumpfend und kann deshalb nur für besondere Zwecke statt des absoluten Alkohols verwendet werden.

2. Formol 10%ige Lösung (10 ccm Formol [S. 5] zu 90 ccm destilliertem Wasser).

Die Objekte verweilen darin 48 Stunden,

kommen dann in Alkohol 96% mindestens 48 "

Diese Formolmischung wird vielfach beim Gebrauch des Gefriermikrotoms verwendet. Die Objekte können Monate lang in der Mischung verbleiben; vor dem Mikrotomieren schneide man eine Scheibe von ca. 5 mm Dicke von dem Objekt und lege sie 24 Stunden lang in Wasser. Dann ohne Alkoholhärtung Aufsetzen auf das Mikrotom (s. S. 21.)

Formol wirkt ähnlich wie Osmiumlösungen[17].

Stärkere (25-50%ige) Lösungen sind zwar ein gutes Mittel für Erhaltung von Zellstrukturen, machen aber das Bindegewebe sehr hart.

3. Alkoholformol. Alkohol 96% 60 ccm + Formol 30 ccm (Schaffer).

Die Objekte verweilen darin 2 Tage,

kommen dann in reinen Alkohol 96% mindestens 2 "

Wasser, auch rein wässerige Farblösungen, sind bei dieser sehr guten, vor allem Schleimgranula fixierenden Methode völlig zu vermeiden.

4. Kalibichromat-Essigsäure (11, S. 5).

Die Objekte verweilen darin 18-24 Stunden,

kommen dann in womöglich fließendes Wasser ca. 3 "

und werden dann in allmählich verstärktem Alkohol gehärtet (S. 17).

Der Vorzug dieser Mischung liegt in dem guten Eindringen der Flüssigkeit und dem raschen Verlauf: Fixation und Härtung sind in 4-5 Tagen vollendet. Die Methode, die mir, mit Ausnahme der Leber, sehr gute Resultate geliefert hat, verlangt nur längere Färbungsdauer, z. B. bei Hansens Hämatoxylin 15-60 Minuten. Durchfärben kleiner Stücke gelingt dagegen leicht.

5. Kalibichromat-Formol (12, S. 5).

Die Objekte verweilen darin 24 Stunden,

kommen dann in 3¹/₂%ige Kalibichromatlösung 3-6 Tage,

werden dann in womöglich fließendem Wasser ausgewaschen 3-6 Stunden,

werden dann in allmählich verstärktem Alkohol gehärtet (S. 17).

6. Müllersche Flüssigkeit (13, S. 5).

Die Objekte verweilen in großen, mehrmals zu wechselnden Quanten (400 ccm) 1-6 Wochen[18],

werden dann in womöglich fließendem Wasser ausgewaschen 4-8 Stunden,

werden dann in destill. Wasser kurz abgespült 1 Minute,

werden dann im Dunkeln (S. 18) in allmählich verstärktem Alkohol gehärtet.

Wer nicht mit peinlicher Gewissenhaftigkeit die oben S. 14 angegebenen allgemeinen Regeln für das Fixieren befolgt, erzielt hier Mißerfolge, für welche dann selbst von sonst erfahrenen Mikroskopikern die schuldlose Müllersche Lösung verantwortlich gemacht wird.

7. Müller-Formol (14, S. 5). Die damit fixierten Objekte werden unter mehrmaligem Flüssigkeitswechsel nach 4 Tagen in reine Müllersche Flüssigkeit übertragen und wie bei dieser weiterbehandelt. Gründliches Auswaschen in Wasser (24 Stunden) wird empfohlen.

8. Zenkersche Flüssigkeit (15, S. 5)[19].

Die Objekte[20] verweilen darin 10-24 Stunden,

dann in (womöglich fließendem) Wasser 10-24 "

dann in destill. Wasser 1 Minute,

werden dann im Dunkeln (S. 18) in allmählich verstärktem Alkohol gehärtet.

Siehe weiter „Behandlung sublimathaltiger Schnitte“.

Die Resultate der Zenkerschen Flüssigkeit sind nur dann gute, wenn Schneiden und Färben bald nach vollendeter Fixierung und Härtung vorgenommen wird. Ein Jahr alte Zenkerpräparate färben sich schlechter, selbst solche, die in Paraffin eingeschmolzen waren. Nur Hämalaun (S. 33) gibt oft noch zufriedenstellende Färbung. Für Organe, die reich an glatten Muskelfasern sind, ist Zenkersche Flüssigkeit weniger zu empfehlen.

9. Sublimatpikrinsäure (26, S. 7)[19] wird wie Zenkersche Flüssigkeit angewendet; die damit fixierten Präparate färben sich sehr gut.

10. Sublimat-Kochsalzlösung (23, S. 6)[19] 20 ccm.

Kleine (höchstens 4 mm) Stücke verweilen darin je nach Größe 1-6 Stunden,

werden dann in allmählich verstärktem Alkohol gehärtet (S. 17).

Diese Lösung wirkt schrumpfend, ist aber ein ausgezeichnetes Mittel zur Fixation von Zell- und Kernstrukturen.

Behandlung sublimathaltiger Schnitte.

Schnitte von den in 8, 9, 10 fixierten Objekten werden vor dem Färben eingelegt in

Jodalkohol (12 ccm Alkohol 90% + 3 Tropfen Jodtinktur) 15 Min., dann in große Mengen von Natriumthiosulfat (10 ccm dieser Lösung

(17, S. 6) + 100 ccm destill. Wasser) 15 Minuten,

dann in destill. Wasser zum Abspülen 1 Minute.

Die Schnitte sind durch das Natriumthiosulfat ganz jodfrei und damit Anilinfarbstoffen gegenüber haltbar geworden (M. Heidenhain).

11. Osmiumsäurelösung (21, S. 6). Beim Gebrauche derselben nehme man sich vor dem Einatmen der die Schleimhäute sehr reizenden Dämpfe in acht. Man fixiert entweder durch Einlegen sehr kleiner (bis 5 mm Seite) Stückchen in die (meist in 1%iger Lösung benützte) Säure, die nur in kleinen Quanten (1-6 ccm) angewendet zu werden braucht, oder dadurch, daß man das feuchte Objekt den Dämpfen der Osmiumsäure aussetzt. Zu letzterem Zwecke gieße man in ein ca. 5 cm hohes Reagenzgläschen ca. 1 ccm der 2%igen Lösung, füge ebensoviel destilliertes Wasser hinzu und stecke das Objekt mit Igelstacheln an die Unterseite des Korkstöpsels, mit welchem man das Reagenzgläschen fest verschließt. Nach 10-60 Minuten (je nach der Größe des Objektes) wird das Stückchen abgenommen und direkt in die in dem Gläschen enthaltene Flüssigkeit geworfen. In beiden Fällen verweilen die Objekte 24 Stunden in der Säure; dabei müssen die Gläser gut verschlossen und im Dunkeln gehalten werden. Dann werden die Objekte herausgenommen, in (womöglich fließendem) Wasser ¹/₂-2 Stunden ausgewaschen, in destilliertem Wasser kurz abgespült und in allmählich verstärktem Alkohol gehärtet (§ 5).

Osmiumsäure-Lösung und -Mischungen schwärzen das Fett; will man osmiertes Fett konservieren (vgl. § 10, 3), so dürfen die Schnitte nicht in Terpentinöl, absolutem Äther oder Xylol, welche osmiertes Fett lösen, aufgehellt werden. Man nehme Chloroform (oder Nelkenöl); zum Einschluß muß mit Chloroform verdünnter Kanadabalsam verwendet werden. Reine Osmiumlösung (aber nicht Mischungen dieser) schwärzt auch Pigment. Ungeeignet sind Osmiumsäure-Lösung und -Mischungen für elastische Fasern, die durch sie wahrscheinlich gelöst werden.

12. Chromosmium-Essigsäure (Flemmings Flüssigkeit) (S. 6), vorzügliches Mittel zur Fixierung der Kernteilungen.

Die Wirkung dieser Mischung auf die Kerne ist an der Peripherie der Stückchen eine andere, als im Innern, wo die Chromatingerüste deutlicher sind, weil in der Peripherie die Osmiumsäure, welche den Kernsaft körnig und das Kerngerüst undeutlicher macht, reiner zur Wirkung kommt.

Man lege ganz frische, noch lebenswarme Stückchen von 3-5 mm

Seite in 4 ccm dieser Flüssigkeit 1 Tag bis 3 Wochen,

dann in (womöglich fließendes) Wasser 1 Stunde (besser länger),

dann in destill. Wasser 1 Minute,

dann Härten in allmählich verstärktem Alkohol (S. 17).

Die zum Fixieren verwendeten Flüssigkeiten können nicht mehr weiter gebraucht werden; man gieße sie weg.

§ 5. Härten.

Mit Ausnahme des absoluten Alkohols erfordern sämtliche Fixierungsmittel eine nachfolgende Härtung der Objekte. Das beste Härtungsmittel ist der allmählich verstärkte Alkohol. Auch hier gilt die Regel, reichlich Flüssigkeit zu verwenden, sowie trüb oder farbig gewordenen Alkohol zu wechseln.

Die in Chromsalzlösungen z. B. in Müllerscher Flüssigkeit fixierten Stücke geben, wenn nicht lange ausgewaschen wurde — und das muß man wegen eintretender Schädigung vermeiden — noch im Alkohol Stoffe ab, die bei gleichzeitiger Einwirkung des Tageslichtes in Form von Niederschlägen auftreten; hält man dagegen den Alkohol im Dunkeln, so entstehen keine Niederschläge, sondern der Alkohol färbt sich nur gelb, bleibt aber klar. Aus diesem Grunde ist oben der Ausschluß des Tageslichtes empfohlen worden; es genügt, die betreffenden Gläser in einer dunklen Stelle des Zimmers aufzustellen. Auch der 90%ige Alkohol muß, so lange er noch intensiv gelb wird, täglich einmal gewechselt werden.

Die zur Härtung benützten Gläser müssen am Boden mit einer 2-4 ccm hohen Schicht entfetteter Watte belegt sein, damit das zu Boden sinkende Wasser nicht in der nächsten Umgebung der zu härtenden Stücke bleibe. Die genauere Handhabung ist folgende: Nachdem die Objekte (in einer der oben aufgezählten Flüssigkeiten) fixiert und, je nach Angabe, in Wasser ausgewaschen sind, kommen sie

in Alkohol 50% 2-6 Stunden,

in Alkohol 70% 10-24 "

in Alkohol 80% 12-24 "

woselbst die Härtung nach weiteren 24-48 Stunden vollendet ist. In diesem Alkohol können die Objekte bis zur definitiven Fertigstellung monatelang verweilen.

Die Aufenthaltsdauer richtet sich nach der Größe des Objektes; unter besonderen Umständen, bei sehr kleinen, zarten Objekten empfiehlt es sich, diese auf je eine Stunde in 40%, 50%, 60%, 70% Alkohol einzulegen.

§ 6. Entkalken.

Die zu entkalkenden Objekte können nicht frisch in die Entkalkungsflüssigkeit eingelegt werden, sie müssen vielmehr vorher fixiert und gehärtet werden.

1. Zu diesem Zwecke fixiere man kleine Knochen (bis zur Größe von Phalangen) und Zähne ganz, von größeren Knochen ausgesägte Stücke (von 33 cm Länge)

in ca. 300 ccm Müllerscher Flüssigkeit (6, S. 15) 2-4 Wochen,

oder in 10%iger Formollösung (2, S. 14) 48 Stunden.

Trockne, mazerierte Knochen bzw. Zähne müssen zuerst ca. 12 Stunden in destilliertem Wasser liegen.

2. Nachdem der Knochen 3 Tage (oder beliebig länger) in 90%igem Alkohol verweilt hat,

kommt er in womöglich fließendes Wasser ca. 24 Stunden,

dann in die Entkalkungsflüssigkeit (konzentrierte Salpetersäure 9 ccm zu 300 ccm Aq. destill.) mehrere Wochen.

Auch hier müssen große Quanten (mindestens 300 ccm) verwendet werden, die anfangs täglich, später alle 14 Tage zu wechseln sind, bis die Entkalkung vollendet ist. Man kontrolliert den Prozeß durch Einstechen mit einer alten Nadel und Einschneiden mit einem Skalpell. Entkalkter Knochen ist biegsam, weich und läßt sich leicht schneiden. Der Entkalkungsprozeß nimmt bei dicken Knochen mehrere Wochen in Anspruch, bei fetalen und kleinen Knochen 3-12 Tage. Nach vollendeter Entkalkung werden die Knochenstücke entsäuert, d. h. sie kommen

in 5%ige wässerige Lösung von Natriumsulfat 12-24 Stunden,

(Die Lösung ist bei großen Stücken nach 6 Stunden zu wechseln)

dann in (womöglich fließendes) Wasser dann abermalige Härtung nach § 5 in allmählich verstärktem Alkohol. 24 "

Bei sehr zarten Objekten (z. B. Schnecken) empfiehlt es sich, das fixierte und gehärtete Objekt vor dem Entkalken in Zelloidin einzubetten (siehe Schaffer, Zeitschr. f. wissensch. Mikroskopie Bd. 19. S. 23).

Anfängern begegnet es nicht selten, daß der Knochen noch vor vollständiger Entkalkung in Alkohol gebracht wird und dann bei Schneideversuchen sich noch unbrauchbar erweist. In solchen Fällen muß dann die Entkalkungsprozedur wiederholt werden. Allzulanges Liegen der Objekte in der Entkalkungsflüssigkeit führt schließlich zu gänzlichem Verderben.

§ 7. Schneiden.

Schnitte lassen sich entweder mit dem Rasiermesser oder mit Hilfe eines Mikrotomes herstellen.

A. Die Rasiermessertechnik.

Das Rasiermesser (s. S. 8) muß scharf sein; das Gelingen guter Schnittpräparate hängt von der Schärfe des Messers ab. Beim Schneiden muß die Klinge mit Alkohol befeuchtet werden (nicht mit Wasser, welches die Klinge nur unvollkommen benetzt). Zu dem Zwecke tauche man das Messer vor jedem dritten oder vierten Schnitte in eine mit ca. 30 ccm 90%igem Alkohol gefüllte flache Glasschale, die zugleich zur Aufnahme der angefertigten Schnitte dient. Das Messer ist horizontal zu halten, leicht zu fassen, der Daumen gegen die Seite der Messerschneide, die übrigen Finger gegen die Messerrückenseite, die Handrückenfläche nach oben gerichtet. Zuerst stelle man an dem zu schneidenden Objekte eine glatte Fläche her, indem man ein Stück von beliebiger Dicke mit einem Zuge vom Objekte trennt. Dann beginnt das Herstellen der Schnitte, die immer mit einem leichten, nicht zu raschen Zuge möglichst glatt und gleichmäßig dünn ausgeführt werden sollen.

Man darf das Messer nicht durch das Objekt drücken, man muß ziehen; zu dem Zwecke muß immer der dem Messergriff zunächst liegende Teil der Messerschneide an das Objekt angesetzt werden.

Es ist geboten, stets eine größere Anzahl (10-20) von Schnitten anzufertigen, die mit der Nadel oder durch Eintauchen des Messers in die Glasschale übertragen werden. Dann stelle man die Schale auf eine schwarze Unterlage und suche die besten Schnitte aus. Die dünnsten Schnitte sind nicht immer die brauchbarsten; für viele Präparate, z. B. für einen Durchschnitt durch sämtliche Magenhäute, sind dickere Schnitte mehr zu empfehlen. Für Übersichtsbilder fertige man große, dicke, für feinere Strukturen kleine, dünne Schnitte an; für letztere genügen oft allerkleinste, durch zu oberflächliche Messerführung erzielte Bruchstücke von 1-2 mm Seite oder Randpartien etwas dickerer Schnitte.

Ist das zu schneidende Objekt zu klein, um nur mit den Fingern gehalten zu werden, so bettet man dasselbe ein. Die einfachste Methode ist das Einbetten bzw. Einklemmen in Leber.

Man nehme entweder Rindsleber oder besser menschliche Fett- oder Amyloidleber (aus pathalog.-anatomischen Instituten zu erhalten), schneide sie in ca. 3 cm hohe, 2 cm breite und 2 cm dicke Stücke, die man sofort in 90%igen Alkohol wirft, der am nächsten Tage gewechselt werden muß; nach weiteren 3-5 Tagen hat die Leber die erforderliche Härte. Nun schneide man eines dieser Stücke von oben her zur Hälfte der Höhe ein und klemme das zu schneidende Objekt in die so entstandene Spalte. Ist das Objekt zu dick, so kann man mit einem schmalen Skalpell Rinnen in die Leber schneiden, in welche das Objekt eingepaßt wird. Das Objekt bedarf keiner weiteren Fixierung (etwa durch Zubinden mit einem Seidenfaden oder dgl.).

Ich klemme die meisten Schnittobjekte in Leber; man kann so sehr feine Schnitte erzielen, sofern man nur einigermaßen Übung hat und die kann man sich in wenigen Wochen leicht aneignen.

B. Die Mikrotomtechnik.

a) Die Mikrotome.

Die gebräuchlichen Mikrotome sind nach zwei verschiedenen Prinzipien konstruiert.

Das Prinzip der einen Art besteht darin, daß das zu schneidende Objekt durch Verschiebung des Objekthalters auf einer schräg aufsteigenden Ebene gehoben wird.

Bei der anderen Art wird das Objekt in vertikaler Richtung durch eine Mikrometerschraube gehoben.

Beide Arten von Mikrotomen leisten Vorzügliches[21].

Alle Teile des Mikrotoms sind möglichst sauber zu halten. Bei häufigem Gebrauche schütze man dasselbe, mit einem leichten Holzkasten bedeckt, vor Staub. Die Bahn, auf welcher der Messerschlitten läuft, muß vollkommen rein sein; man putze dieselbe hie und da mit einem in Benzin getauchten Lappen und fette sie dann mit Knochenöl oder mit Vaselin so reichlich ein, daß der Schlitten auch bei leichtem Anstoße die ganze Bahn gleichmäßig durchläuft[22]. Besondere Sorgfalt ist auf die Messer zu verwenden. Nur mit sehr scharfen Messern wird man Serien sehr feiner Schnitte herstellen können. Ein wirklich scharfes Messer muß ein feines Haar, das man an dem einen Ende zwischen den Fingern hält, mit Leichtigkeit durchschneiden.

b) Die Gefriermethode.

Diese Methode bietet den Vorteil, daß sich relativ rasch gute Präparate von unfixiertem und fixiertem Material herstellen lassen. Am meisten verwendet man zur Anfertigung von Gefrierschnitten formolfixiertes Material, während Blöcke von alkoholfixierten Geweben erst nach Ersatz des Alkohols durch Wasser, Sublimatmaterial dagegen nur schlecht in Gefrierschnitte zerlegt werden können.

Am gebräuchlichsten ist folgendes Verfahren:

1. Fixation in 10%igem Formol 24-48 Stunden,

2. Wässern 24 "

3. Schneiden.

Hierzu verwendet man am besten ein kleines Mikrotom (Jungsches Studentenmikrotom), das mit Gefriereinrichtung geliefert wird. Das Durchfrieren der Blöcke geschieht mit Kohlensäure, die man aus einer Bombe durch die Gefriereinrichtung in beliebiger Geschwindigkeit in der Umgebung des auf dem Objekttisch liegenden Gewebsblockes ausströmen läßt. Den vorher etwas angefeuchteten Block drückt man dabei mit der Fingerkuppe leicht an den Objekttisch an.

Am besten läßt man die Kohlensäure in ganz kurzen, rasch aufeinanderfolgenden Stößen auf das Objekt einwirken. Dieses muß langsam vollständig erstarren; man darf deshalb von größeren Organen nur etwa 0,5 cm dicke Scheiben verwenden. Die Übung lehrt einen Erstarrungsgrad herausfinden, der die besten Ergebnisse liefert. Zu stark gefroren, splittert der Block und schädigt die Messerschneide, zu wenig gefroren schiebt sich das Gewebe zusammen, so daß man keine exakten Schnitte bekommt.

Bei richtiger Anwendung lassen sich aber tadellose Schnitte von den allermeisten Objekten herstellen. Man stelle im Durchschnitt die Schnittdicke auf 10 bis 15 µ ein; allzu dünne Schnitte können nur bei größerer Übung erzielt werden.

Nach ausreichender Erstarrung hebelt man den Messerhalter so lange über das Objekt, bis eine gute Schnittfläche hergestellt ist. Bei richtiger Messerführung hebt sich durch die Hebelübertragung der Objekttisch bei jedem Schnitt um die eingestellte Dickenzahl. Die Schnitte, die auf dem Messer gewöhnlich sehr rasch schmelzen, übertrage man mit einem weichen Pinsel oder mit der Fingerkuppe in eine Schale mit ausgekochtem Wasser (bei gewöhnlichem Wasser fangen sich leicht Luftblasen an den Schnitten). Im Wasser breiten sie sich von selbst wieder aus.

Vorsichtig mit einer gebogenen Nadel aus einem Schälchen in das andere übertragen, lassen sich die zarten Schnitte den verschiedensten Färbeverfahren unterwerfen.

Die Gefriereinrichtung ist auch einzeln käuflich und läßt sich an jedem Mikrotom anbringen.

c) Einbetten.

α) In Paraffin.

Hierzu bedarf man:

1. Paraffin: zwei Sorten, eine weichere (45° C Schmelzpunkt) und eine härtere (52° C Schmelzpunkt). Davon stelle man sich eine Mischung her, die bei ca. 50° C schmelzbar ist. Von dem richtigen Mischungsverhältnisse beider Sorten hängt viel ab; mancher Mißerfolg wird nur durch eine ungenügende Mischung herbeigeführt.

Eine genaue Angabe der Mengenverhältnisse läßt sich nicht liefern, da die Konsistenz des Paraffins in hohem Grade von der äußeren Temperatur abhängig ist. Auch bedingen härtere Objekte, ferner der Wunsch, sehr feine Schnitte herzustellen, die Anwendung härterer Mischungen als gewöhnlich. Für den Winter, bei einer Zimmertemperatur von 20° C dürfte eine Mischung von 30 g weichem mit 25 g hartem Paraffin[23] den meisten Anforderungen genügen.

2. Chloroform 20 ccm.

3. Paraffinchloroform, eine gesättigte Lösung (5 g der Mischung in 25 ccm Chloroform). Diese Lösung ist bei Zimmertemperatur flüssig.

4. Ein Trockenofen („Thermostat“) aus Kupferblech mit doppelten Wänden, deren Zwischenraum mit Wasser gefüllt ist. Unter dem Kasten brennt eine kleine Gasflamme. Oben befinden sich drei Öffnungen; zwei führen in den erwähnten Zwischenraum, in die eine wird ein Reichertscher Regulator, in die andere ein Thermometer eingesetzt[24]. Die dritte Öffnung führt in den Luftraum des Kastens. Hier wird ein zweiter Thermometer eingesetzt.

Der Wärmekasten mit Zubehör ist für denjenigen, der viel mit Paraffin arbeitet, kaum entbehrlich. Man kann jedoch statt dessen das Paraffin auf dem Wasserbade schmelzen und durch eine kleine Spiritusflamme flüssig erhalten.

5. Ein Einbettungsrähmchen. Dasselbe besteht aus zwei geknickten Metallplatten, die so

aneinander gesetzt werden.

Statt dieses Rähmchens kann man sich aus Stanniol oder steifem Papier (alten Korrespondenzkarten) geformter Kästchen bedienen.

Die einzubettenden Objekte müssen vollkommen wasserfrei sein, 1 bis 3 Tage in mehrmals gewechseltem absolutem Alkohol gelegen haben. Dann werden sie in Fläschchen mit ca. 20 ccm Chloroform übertragen, woselbst sie bis zum nächsten Tage, bei kleinen Objekten kürzer, verweilen. Danach kommen die Objekte in Paraffinchloroform (s. oben) und nach 2 bis 24 Stunden je nach der Größe und Beschaffenheit der Stücke in ein Schälchen geschmolzenen, aber nicht zu heißen Paraffins.

Das Paraffin darf nur 2-3 Grade über seinen Schmelzpunkt erhitzt sein; für die oben angegebene Mischung soll die Luft im Wärmekasten eine Temperatur von ca. 53° C haben. Hat man das Paraffin auf dem Wasserbade geschmolzen, so stelle man die Flamme so, daß die Oberfläche des Paraffins mit einem dünnen Häutchen erstarrten Paraffins bedeckt bleibt.

Nach etwa einer halben Stunde werden die Stückchen in ein zweites Schälchen geschmolzenen Paraffins gebracht, woselbst sie je nach der Größe 1-5 Stunden bleiben.

Das geschieht, um den letzten Rest des Chloroforms aus dem Objekte zu entfernen. Selbstverständlich muß immer das gleiche Schälchen für die Übertragung aus dem Paraffinchloroform benützt werden. Enthält das Schälchen nach häufigerem Gebrauche viel Chloroform, so kann man dieses durch stärkeres Erhitzen des Paraffins austreiben. So lange das Paraffin noch Chloroform enthält, steigen von einer eingetauchten heißen Nadel Bläschen auf.

Nach Ablauf der angegebenen Zeit nehme man einen tiefen Teller, lege einen Objektträger hinein und stelle auf diesen das mit Glyzerin in dünner Schicht bestrichene Einbettungsrähmchen, in welches jetzt Paraffin und Objekt gegossen werden. Dann gebe man, so lange das Paraffin noch flüssig ist, dem Objekt mit erhitzten Nadeln die gewünschte Lage. Sobald das geschehen ist, gieße man in den Teller vorsichtig kaltes Wasser bis zum oberen Rande des Rähmchens; das Paraffin beginnt sofort zu erstarren, worauf man noch mehr Wasser zugießt, bis das ganze Rähmchen unter Wasser steht. Durch diese Manipulation erhält das Paraffin eine homogene Beschaffenheit, während es sonst leicht kristallinisch wird und dann sowohl schwerer zu schneiden ist, als auch auf die Struktur der eingeschlossenen Teile schädlich einwirkt. Nach etwa 10 Minuten werden die Metallplatten abgenommen und der Paraffinblock bis zur vollkommenen Erstarrung auf dem Objektträger im Wasser belassen.

Das so eingeschmolzene Objekt ist schon nach einer halben Stunde schneidbar; soll es später verarbeitet werden, so wird es mit einer Nadel signiert und kann bis zum Schneiden unbegrenzt lange Zeit aufgehoben werden.

β) In Zelloidin.

Das in Platten käufliche (bei Dr. Grübler) Zelloidin hat die Konsistenz speckigen Käses. Man zerschneide die Platte in kleine Stückchen und lasse sie an einem staubfreien Orte an der Luft trocknen, wobei sie gelb und steinhart werden. 16 g dieses trockenen Zelloidins werden in 100 ccm absolutem Alkohol + 100 ccm Äther gelöst. Die Hälfte dieser 8%igen Lösung mit 50 ccm absolutem Alkohol + 50 ccm Äther verdünnt. Die Hälfte dieser 4%igen Lösung mit 25 ccm abs. Alkohol + 25 ccm Äther verdünnt.

Alle drei Lösungen sind in gut verschlossenen weithalsigen Flaschen aufzubewahren. Diese stellt man in gut verschließbare größere Gefäße, die Alkohol absol. enthalten und auf deren Boden sich 15-20 g weißgeglühtes Kupfervitriol befindet (S. 4). Wenn das Zelloidin zu sehr eingedickt ist, kann es durch Zugießen von Äther-Alkohol verdünnt werden.

Nach einiger Zeit werden die Lösungen trüb und milchig; es ist alsdann besser die Lösung vollkommen eintrocknen zu lassen und die Stücke von neuem in Äther-Alkohol zu lösen.

Die einzubettenden Stücke müssen vollkommen wasserfrei sein, 1 bis 2 Tage in mehrmals gewechseltem absolutem Alkohol gelegen haben. Aus diesem werden die Stücke auf je 24 Stunden in Äther-Alkohol (zu gleichen Teilen) in die 2%ige, 4%ige und 8%ige Zelloidinlösung übertragen. Hier können die Stücke beliebig lange verweilen. Meist sind sie nach 24 Stunden hinreichend durchtränkt, nur große, viele Binnenräume enthaltende Objekte müssen länger (bis zu 8 Tagen) in der dicken Lösung verweilen. Dann wird das Stück rasch auf einen Korkstöpsel oder einen kleinen Holzklotz, die man vorher mit Alkohol-Äther durchtränkt[25], aufgesetzt und etwas Zelloidin darübergegossen. Dabei ist zu beachten, daß das Objekt nicht fest auf den Kork aufgedrückt werde, sonst löst es sich leicht ab. Es muß sich eine 1-2 mm dicke Schicht zwischen Kork und Objekt befinden.

Dicker darf die Schicht nicht sein; auch gut gehärtetes Zelloidin ist elastisch, eine dicke Schicht solch elastischen Materials würde zu einem Ausweichen des Objektes beim Schneiden Veranlassung geben.

Nun wird das Ganze ¹/₂ Stunde (zarte Objekte) bis 4 Stunden unter eine nicht fest schließende Glasglocke zu langsamer Trocknung gebracht und dann in eine Glasdose mit ca. 30 ccm 80%igem Alkohol übertragen. Damit die Objekte untertauchen, klebe man die Korkstöpsel mit ihrer unteren Fläche vermittelst Zelloidin an die Innenfläche des Dosendeckels. Am nächsten Tage wird der 80%ige Alkohol durch 70%igen Alkohol ersetzt, in welchem die Stücke lange aufgehoben werden können.

Man kann auch die in Zelloidin einzubettenden Stücke zu späterer Verarbeitung aufheben. Das Objekt wird dann aus dem 8%igen Zelloidin in ein Schälchen gebracht, das fest zugedeckt mehrere Stunden stehen bleibt, bis die beim Gießen entstandenen Luftblasen entwichen sind. Dann nehme man den Deckel ab und lasse das Schälchen unter einer Glasglocke so lange stehen, bis sich eine Haut auf der Oberfläche gebildet hat (6-12 Stunden). Dann kommt das Schälchen samt Inhalt in 70%igen Alkohol; nach 24 Stunden schneidet man aus dem erstarrten Zelloidin einen das Präparat enthaltenden Block zurecht und konserviert in 70%igen Alkohol.

Sollen solche konservierten Blöcke auf Kork aufgeklebt werden, so müssen sie zuvor auf ¹/₂ Stunde in Alkohol absol., und dann 5 Minuten in dickes Zelloidin eingelegt werden.

Zur Anfertigung feinerer Schnitte kann man das Zelloidin noch härten. Zu diesem Zwecke bringe man die in Zelloidin eingeschlossenen Stücke aus dem 70%igen Alkohol auf 2 Tage oder beliebig länger in ein Alkohol-Glyzeringemisch (Alkohol 80% 1 Teil, reines konzentriertes Glyzerin 6-10 Teile). Je größer das Verhältnis von Glyzerin zu Alkohol ist, desto härter wird das Zelloidin.

Man kann die Mischung noch mehr ändern. Als äußerste Grenze dürfte 1 Teil Alkohol zu 30 Teilen Glyzerin zu bezeichnen sein; noch stärkere Differenzen führen zu einem starken Rollen der Schnitte; siehe ferner Neumayers Angabe zur Technik der Zelloidineinbettung (Zeitschr. für wissensch. Mikroskopie Bd. XXV, S. 38).

Um das Federn der elastischen Zelloidinblöcke zu verhindern, trockne man den aus dem Alkohol-Glyzerin entnommenen Block mit Filtrierpapier sorgfältig ab, mache ein paar seitliche Einkerbungen und tauche ihn in flüssiges Paraffin. Solche Blöcke lassen sich nicht trocken aufheben. Man lege sie in das Alkohol-Glyzerin zurück.

Einer besonderen Behandlung bedürfen die mittelst der Golgischen Methode fixierten Präparate, da ein länger als eine Stunde dauernder Aufenthalt in absolutem Alkohol oft schädlich wirkt. Das aus der Silberlösung genommene Stückchen wird 15-20 Minuten in 30 ccm 96%igem, dann 15 Minuten in ebensoviel absolutem Alkohol gehärtet, dann auf 5 Minuten in die dünne Zelloidinlösung gebracht. Unterdessen schneidet man in die plangeschnittene Seitenfläche eines möglichst breiten Stückes Holundermark eine Vertiefung, gerade groß genug, um das ganze Präparat eben aufzunehmen, welches hier eingefügt und mit etwas Zelloidin übergossen wird. Dann setze man ein zweites Stückchen Holundermark auf, gieße wieder etwas Zelloidin über und stelle das Ganze auf ca. 5 Minuten zum Antrocknen unter eine Glasglocke. Dann Übertragung in 80%igen Alkohol auf 5 Minuten und dann mit einem mit 80%igem Alkohol benetzten Messer schneiden. Mikrotom ist durchaus nicht nötig, es lassen sich leicht mit freier Hand genügende Schnitte herstellen. Benützt man ein Mikrotom, so soll die Schnittdicke zwischen 40 und 120 µ schwanken. Es empfiehlt sich, an der Schnittfläche so viel Holundermark abzutragen, daß letzteres nur eine (1 mm) schmale Rinde um das Zelloidin bildet.

γ) In Zelloidin-Zedernöl-Paraffin.

Diese Methode ist für kleine Objekte, die mit feineren Methoden untersucht werden sollen (Plastosomen, Vitale Färbung u. a.), besonders dann zu empfehlen, wenn Schnittserien erforderlich sind, anderseits die bei Paraffin unvermeidlichen Schrumpfungen vermieden werden sollen. Zuverlässig arbeitet die Methode besonders bei kleinen Objekten (bis zu 0,5 cm Kantenlänge bei würfelförmigen Blöcken).

Man braucht drei verschiedene Mischungen von Zelloidin, denen etwas Zedernholzöl beigemengt ist. Wie beim Zelloidin (s. S. 24) muß bei der Aufbewahrung dieser Mischungen sorgfältig auf dichten Abschluß gegen die Luftfeuchtigkeit geachtet werden.

Die Mischungen sollen folgendermaßen zusammengesetzt sein:

Zelloidin I: 4 Teile 2%iges Zelloidin und 1 Teil Zedernöl.

Zelloidin II: 4 Teile 4%iges Zelloidin und 1 Teil Zedernöl.

Zelloidin III: 5 Teile 8%iges Zelloidin und 1 Teil Zedernöl.

Über die Herstellung der Zelloidinlösungen s. S. 23.

Die Objekte kommen aus Alk. abs. auf 24 Stunden in Äther-Alkohol (zu gleichen Teilen), hierauf nacheinander in die 3 Zelloidinmischungen, in denen sie je nach der Größe einen Tag bis mehrere Wochen verweilen. Ganz kleine Objekte, wie Nierenstückchen von 2 mm Kantenlänge habe ich im Laufe von 2 Tagen mit gutem Erfolge durch die 3 Mischungen hindurchgeführt.

Aus der 3. Mischung bringt man die Objekte in ein möglichst kleines Papierkästchen mit so viel von Zelloidin 3, daß die Objekte gerade damit bedeckt sind. Das Kästchen läßt man dann in einer flachen Schale auf Chloroform gut zugedeckt etwa 10 Minuten schwimmen, bis sich durch die Chloroformdämpfe die oberflächliche Schichte des Zelloidins gehärtet hat. Dann taucht man den ganzen Block in Chloroform unter, bis er nach 3-4 Stunden ganz durchgehärtet ist.

Wenn man sich davon überzeugt hat, daß der Block gut durchgehärtet ist, schneidet man vorsichtig das Zelloidin möglichst knapp bis an die Objektoberfläche weg und bringt das Objekt für 12-24 Stunden in Chloroform-Paraffin, dem man 3-5 Tropfen Zedernöl (auf etwa 10 ccm) zugemischt hat. In dieser Mischung stellt man das Objekt oben auf den Trockenschrank, nachdem unter das Schälchen noch ein umgestülptes Gefäß gestellt worden ist. Unter allen Umständen muß eine zu starke Erwärmung vermieden werden.

Dann für je 10 Minuten in Paraffin I und II und Einbetten wie bei Paraffinbehandlung.

Nur die Übung lehrt, die Konzentration des Zelloidin 3 mit dem Härtegrad des Einbettungsparaffins so in Übereinstimmung zu bringen, daß die Schnittfähigkeit ein Optimum erreicht. Aber in den meisten Fällen erzielt man ausreichende Resultate.

d) Schneiden und Weiterbehandeln der Schnitte.

α) Paraffinobjekte.

1. Der Paraffinblock wird zuerst zurechtgeschnitten, d. h. durch schichtweises Abtragen des Paraffins in eine vierseitige Form gebracht. Hierbei soll ringsherum eine 1-2 mm dicke Paraffinschicht um das Objekt erhalten bleiben. Auf die Schnittfläche achten!

2. Aufblocken: entweder auf Würfel von Hartholz, die man sich in passender Größe von jedem Schreiner herstellen lassen kann oder auf Metalltischchen, die vielfach den Mikrotomen beigegeben sind. In beiden Fällen überzieht man diesen Träger mit einer ca. 1-2 mm dicken Paraffinschicht, die heiß aufgetragen wird, setzt unmittelbar hintereinander mit der rechten Hand einen in einer Spiritusflamme erwärmten Metallspatel auf die Paraffinschicht des Trägers und mit der linken Hand die Unterfläche des Paraffinblockes auf den Spatel, zieht dann unter leichtem Druck auf den Paraffinblock den Spatel unter diesem weg. Drückt man dann den Paraffinblock auf den Träger fest auf, so erstarrt das Paraffin wieder; zum Schlusse verstreicht man mit dem erwärmten Spatel die Berührungskanten von Block und Träger und legt das Ganze für mindestens 5 Minuten in kaltes Wasser.

Man schneidet den Paraffinblock so niedrig als es die Objektgröße erlaubt, da mit der Höhe des Blockes die Federung zunimmt, worunter die Exaktheit der Schnitte leidet.

3. Schneiden mit querer Messerstellung. Nur weiche und kleine Objekte lassen sich gewöhnlich so schneiden, daß man das Messer senkrecht zur Achse des Mikrotoms einstellt. Je nach dem Härtegrad des Paraffins kann man bei dieser Messerstellung Schnitte von jeder gewünschten Schnittdicke (2-30 µ) rasch hintereinander schneiden, so daß sie in Bandform aneinander haften. Dazu ist Voraussetzung, daß die dem Messer zugewandte Fläche des Blockes mit der Messerschneide und mit der vom Messer abgewandten Fläche genau parallel steht. Diese Methode erfordert große Übung. Dem Anfänger sei geraten, jeden Schnitt einzeln vom Messer zu nehmen; nur, wenn jeder Schnitt gleichmäßig „kommt“ ist eine zuverlässige Schnittdicke erreicht.

4. Schneiden bei schräger Messerstellung. Handelt es sich um große Objekte von ungleichem Gefüge, so soll das Messer in einem zur Längsachse des Mikrotoms möglichst spitzen Winkel festgeschraubt werden. Die Paraffinsäule muß so zur Messerschneide stehen, daß diese zuerst eine Kante der Säule trifft. Der Messerschlitten ist langsam zu bewegen, jeder Druck dabei ist zu vermeiden.

5. Mißstände beim Schneiden und deren Beseitigung. Jeder, der mit Paraffin gearbeitet hat, wird über manchen mißlungenen Versuch zu berichten wissen.

Oft gleitet das Messer über das Objekt und trennt einen Schnitt entweder unvollkommen oder gar nicht.

Die Ursache hierfür kann zunächst im Mikrotom liegen. Die Bahn des Messerschlittens ist nicht sauber (man achte auch auf den vertikalen Teil der Schlittenbahn), oder das Messer ist nicht scharf genug, oder es ist an der Unterfläche mit Paraffin beschmutzt. In letzterem Falle wird der Messerschlitten herausgehoben, das Messer vorsichtig mit Terpentinöl und einem weichen Lappen gereinigt. Messer mit dünnem Rücken federn, wenn man den vordersten Teil der Schneide benutzt; so kommt es, daß bei schräger Messerstellung die Schneide nur im Anfange des Schnittes eingreift und über den letzten Teil des Präparates erfolglos weggleitet. Auch eine steilere Einstellung der Messerschneide durch keilförmige Eisenplättchen oder durch verstellbare Messerhalter beseitigt oft Schwierigkeiten. Bei Mikrotomen älterer Konstruktion liegt der Grund oft in ungenügender Feststellung des Paraffinblockes.

In zweiter Linie ist die Ursache im Objekt zu suchen. Dasselbe ist vielleicht zu hart, oder sehr ungleichen Gefüges, oder schlecht eingebettet. In letzterem Falle liegen zwei Möglichkeiten vor. Entweder das Präparat war nicht gehörig entwässert, dann zeigt es undurchsichtige Flecken, oder es enthält noch Chloroform; in diesem Falle ist es weich, ein leichter Druck mit der Nadel auf die Oberfläche des Präparates ausgeübt, hinterläßt eine Delle oder preßt gar Flüssigkeit aus. In beiden Fällen muß die Einbettungsprozedur in umgekehrter Reihenfolge bis zum absoluten Alkohol (in letzterem Falle bis zum Paraffinbade) wiederholt werden.

Endlich kann die Konsistenz des Paraffins schuld sein.

Die Schnitte rollen sich.

Das kann verhindert werden, indem man einen Pinsel oder eine gebogene Nadel gegen den sich rollenden Schnitt hält. Der Grund des Rollens liegt in dem zu harten Paraffin, das auch schuld ist, wenn

die Schnitte bröckeln.

Die Brauchbarkeit des Paraffins ist in hohem Grade abhängig von der äußeren Temperatur. Ist das Paraffin zu hart, so suche man nicht sogleich durch Beimischung von weichem Paraffin eine passende Konsistenz herzustellen — das sei der letzte Ausweg —, sondern versuche zuvor einfachere Mittel. Man schneide in der Nähe des Ofens oder (bei Gasbeleuchtung) mit nahegerückter Lampe. Oft führt schon ein leichtes Erwärmen des Messers zum Ziele.

Selbst ganz gutes Paraffin bröckelt, wenn es mit kaltem Messer geschnitten wird.

Die Schnitte falten sich und werden zusammengedrückt. Dadurch erhalten die geschnittenen Objekte eine falsche Form. Der Grund liegt in zu weichem Paraffin. Öfteres Einlegen des Blockes in kaltes Wasser, Schneiden im kalten Zimmer (im Sommer in den Morgenstunden) beseitigen diesen Übelstand.

6. Aufkleben der Schnitte. Nur dicke Schnitte werden, sofern sie von einem durchgefärbten Stück stammen, auf den Objektträger gebracht und, nachdem das Paraffin durch Xylol herausgelöst ist, gleich nach den (S. 45) angegebenen Regeln eingelegt.

In der Mehrzahl der Fälle müssen die Schnitte zuerst aufgeklebt werden. Die hier zu verwendenden Objektträger müssen ganz rein sein; man putze sie mit etwas Alkohol und einem sauberen, nicht fetten Tuche oder lege sie auf eine halbe Stunde in kaltes Seifenwasser. Auf den gut getrockneten Objektträger wird ein kaum stecknadelkopfgroßer Tropfen Eiweiß-Glyzerin[26] zu einer kaum sichtbaren Schichte verstrichen; der Objektträger wird dann mit einem Tropfen destilliertem Wasser beschickt, und die Schnitte werden auf dem Wasser ausgebreitet und in bestimmter Reihenfolge angeordnet. Beachte dabei die Größe des zu verwendenden Deckglases! Nun ziehe man den Objektträger durch eine Spiritusflamme oder bringe ihn 1-3 Minuten in den Wärmekasten. Durch die leichte Erwärmung breiten sich die Schnitte glatt aus.

Das Paraffin darf nicht schmelzen; die aus geschmolzenem Paraffin und Wasser entstandene Mischung ist in Karbolxylol nicht mehr löslich.

Dann ordne man die Schnitte noch einmal mit einer Nadel, lasse durch leichte Neigung des Objektträgers das überflüssige Wasser abfließen oder sauge es mit einem Streifen Filtrierpapier ab und lasse das Ganze, vor Staub geschützt, gut trocknen. Am nächsten Tage wird der Objektträger mit Xylol übergossen und, wenn die Schnitte schon gefärbt sind, in Xylolbalsam (S. 45) eingeschlossen. Sollen dagegen die Schnitte auf dem Objektträger noch gefärbt werden, so wird der Objektträger aus Xylol in absoluten Alkohol übertragen. Nach ca. 5 Minuten wird der Objektträger aus dem Alkohol genommen, in der Umgebung der Schnitte rasch abgewischt, angehaucht und entweder in die Farbe gelegt oder mit einigen Tropfen der Farblösung, z. B. Hämatoxylin (direkt auf die Schnitte) bedeckt. Von da wird der Objektträger langsam in eine Schale mit destilliertem Wasser gebracht und dann entweder in dünnes Glyzerin (S. 44) oder nach bekannter Vorbehandlung mit absolutem Alkohol und Karbolxylol (S. 45) in Xylolbalsam eingeschlossen.

Ein Ablösen der Schnitte kommt nur dann vor, wenn das Wasser nicht in genügender Menge — zwischen Schnitten und Objektträger muß das Wasser ganz ausgebreitet sein — zugesetzt war. Man kann auch auf Deckgläschen aufkleben, dadurch wird das Einlegen in Farbe, Alkohol usw. weniger kostspielig.

β) Zelloidinobjekte.

Block und Messer müssen dauernd unter Alkohol feucht gehalten werden.

Der Alkohol soll je nach Bedarf 70-80%ig sein; Alkohol von niederer Konzentration härtet den Zelloidinblock mehr.

Die Schnitte werden in Alkohol aufbewahrt, man nimmt sie einzeln mit einem Pinsel vom Messer. Das Messer soll mit einem möglichst langen Teil der Schneide durch das Objekt gezogen werden, muß also extrem „schräg“ stehen.

Dünne Schnitte, die sich beim Schneiden leicht in Falten legen, breite man möglichst auf dem Messer noch mit dem Pinsel aus, da länger vorhandene Falten sich später oft schwer aus den Schnitten wegbringen lassen.

Das Färben von Zelloidinschnitten wird durch das Zelloidin ziemlich stark gestört, da sich diese Substanz vielfach intensiv mit färbt; selbst Hämatoxylin verleiht dem Zelloidin oft einen leicht blauen Ton und soll deshalb nur in verdünnter Lösung angewendet werden. In absoluten Alkohol dürfen die Schnitte nicht gebracht werden, da dieses das Zelloidin löst. Sie werden aus 96%igem Alkohol in Karbolxylol aufgehellt und in Xylolbalsam eingeschlossen.

Schnittserien von Zelloidinobjekten kommen nur für ganz spezielle Zwecke, z. B. für das Zentralnervensystem in Betracht. In dieser Hinsicht seien die Artikel von Weigert[27], von Obregia[28] und von Maximow[29] bestens empfohlen.

γ) Zelloidin-Paraffinobjekte.

Im allgemeinen wird wie beim Paraffinverfahren aufgeblockt und geschnitten. Sehr oft macht es aber Schwierigkeiten, die Schnitte vollständig eben auf dem Objektträger aufzukleben, weil beim Strecken die umgebende Paraffinschicht ein von dem des eingeschlossenen Zelloidins abweichendes Ausdehnungsbestreben hat. Man entferne dann vor dem Schneiden den Paraffinmantel streckenweise und lege auch beim Serienschneiden jeden Schnitt einzeln auf den Objektträger, nachdem er schon auf dem Messer möglichst geglättet ist. Mit dieser Vorsichtsmaßnahme gelingt es fast immer, glatte, tadellose Schnittserien zu bekommen.

Die Schnitte werden ebenso aufgeklebt wie Paraffinschnitte; nach dem Entfernen des Paraffins durch Xylol kommen die Präparate in Alk. abs., von da zur Auflösung der das Färben störenden Zelloidinschichte in Alkohol-Äther (zu gleichen Teilen) auf 5 Minuten. Danach lassen sich die Schnitte allen Färbemethoden unterwerfen wie Paraffinschnitte.

§ 8. Färben.

Im Gegensatz zur technischen Färberei kommt es beim Färben zu mikroskopischen Zwecken darauf an, verschiedene Bestandteile des Körpers durch Farbstoffbehandlung deutlicher zu unterscheiden. Durch geeignete Farbstoffkombinationen gelingt es, gleichzeitig eine größere Zahl verschiedener Strukturen durch charakteristische Farbtöne hervorzuheben. Es liegt nahe, anzunehmen, daß eine chemische Verschiedenheit in der Zusammensetzung der einzelnen Strukturbestandteile für die Verbindung mit jeweils bestimmten Farbstoffen verantwortlich sei. Für die übergroße Mehrzahl der Fälle trifft diese Annahme aber nicht zu. Trotz großer Bemühungen, eine sichere theoretische Grundlage für die Färbemethoden zu finden, läßt es sich heute noch nicht sicher sagen, ob elektrochemische, adsorptive Oberflächenkräfte oder konstitutionschemische Einflüsse für gewisse Färbungsergebnisse eine Erklärung abgeben können.

Für Färbeversuche kommt es einmal auf die Eigenschaften und die Beschaffenheit des zu gelingt es, gleichzeitig eine größere Zahl verschiedener Strukturen durch charakteristische Farbtöne hervorzuheben. Es liegt nahe, anzunehmen, daß eine chemische Verschiedenheit in der Zusammensetzung der einzelnen Strukturbestandteile für die Verbindung mit jeweils bestimmten Farbstoffen verantwortlich sei. Für die übergroße Mehrzahl der Fälle trifft diese Annahme aber nicht zu. Trotz großer Bemühungen, eine sichere theoretische Grundlage für die Färbemethoden zu finden, läßt es sich heute noch nicht sicher sagen, ob elektrochemische, adsorptive Oberflächenkräfte oder konstitutionschemische Einflüsse für gewisse Färbungsergebnisse eine färbenden Materials, dann vor allem auch auf die Eigenschaften der Farbstofflösung an. Ein und dasselbe Material färbt sich ganz verschieden, je nachdem, ob es lebend, tot, aber unfixiert, oder ob es endlich fixiert der Farbstoffwirkung ausgesetzt wird. Ziemlich konstant ist die Färbung im Lebendzustande, die wir „vitale Färbung“ nennen, ebenso die Färbung fixierter Präparate. Totes unfixiertes und schlecht fixiertes Material verhält sich je nach den Umständen sehr verschieden. Geringe, für manche Strukturelemente aber sehr wesentliche Einflüsse werden von der Art des angewandten Fixationsmittels ausgeübt. Deshalb werden im speziellen Teil für bestimmte Färbungen besondere Fixationsmethoden empfohlen.

Aber auch die Auswahl und die Anwendungsart der Farbstoffe ist von allergrößter Bedeutung sowohl für die vitale Färbung wie für die Färbung des fixierten Objekts. Die gebräuchlichsten Farbstoffe werden in saure (oxychrome), basische (basochrome) und indifferente Farbstoffe eingeteilt; die meisten Farbstoffe sind Salze, bei denen der Farbcharakter entweder an der Base (basische) oder an der Säure (saure) haftet. In bestimmter Anwendungsweise, besonders aus wässeriger Lösung zeigen basische und saure Farbstoffe eine sozusagen gegensätzliche Wirkung auf bestimmte Strukturelemente des Gewebes, so daß man im allgemeinen z. B. die sauren Farbstoffe als Plasmafarbstoffe, die basischen als Kernfarbstoffe bezeichnet hat. Doch gelingt es, bei etwas abweichender Methodik die genannte Farbstoffwirkung auch völlig umzukehren, was davor warnt, in diesen Verhältnissen etwa chemische Gesetzmäßigkeiten zu erblicken.

Sehr wichtig für die Wirkung des Farbstoffes ist das Lösungsmittel und die Konzentration, in der er dargeboten wird. Leicht diffundierende Farbstoffe dringen sehr rasch in die Gewebe ein, bringen aber für gewöhnlich keine haltbaren Färbungen hervor. Dagegen geben schwerer diffundierende Farbstoffe eine Reihe von ausnehmend schönen Kontrastfärbungen, so daß sie speziell zur Darstellung feinerer Strukturen verwandt werden können. Solche Kontraste, die sich in wässeriger Lösung der Farbstoffe erzielen lassen, verschwinden vielfach, wenn man die Präparate in Alkohol überführt, weil die meisten Farbstoffe in Alkohol leichter diffundieren, und sich so leichter auch in vorher ungefärbte Strukturbestandteile ausbreiten können.

Dieselbe Wirkung des Alkohols wird beim Färben sehr oft absichtlich ausgenutzt, indem man die Präparate in einer wässerigen Farblösung zunächst „überfärbt“, sie dann im Alkohol „extrahiert“. Man kann sich dann unter dem Mikroskop von dem „Differenzierungsgrad“ schrittweise überzeugen und die Entfärbung durch das Fertigmachen des Präparates unterbrechen. Diese Art des Färbens nennt man regressive Färbung im Gegensatz zur progressiven Färbung, bei der man von vornherein nur so lange färbt, bis der gewünschte Effekt erreicht ist.

Die Löslichkeit der Farbstoffe und damit auch die Färbeeigenschaften werden oft durch bestimmte Zusätze zu den Farbstofflösungen (Salze u. a.) verändert. Soweit die Färbekraft durch solche Zusätze erhöht wird, spricht man vielfach von Beizen. Man kann nämlich einen ähnlichen Effekt erzielen, wenn man das Gewebe vorher mit dem betreffenden Salz behandelt, statt das Salz der Farbstofflösung zuzusetzen.

Gerade die Verschiedenartigkeit der unzähligen bekannten Farbstoffe in bezug auf ihre Lösungseigenschaften und die Veränderlichkeit dieser Löslichkeit durch bestimmte Zusätze scheint die Hauptgrundlage der außerordentlich zahlreichen Färbungsvorschriften zu sein[30].

Bei der Unsicherheit in der theoretischen Deutung der Färbemethoden sei dem Anfänger empfohlen, sich so genau wie möglich an die erprobten Vorschriften zu halten. Nur so wird er es lernen, die schwierige Färbetechnik zu beherrschen. Mit dem Fortschreiten in der technischen Fertigkeit ergibt sich ein Eindringen in die theoretischen Grundlagen des Färbens als notwendig. Bei dem heutigen Stande dieser Grundlagen darf die Färbemethodik nur als ein Mittel betrachtet werden, bekannte Strukturen zu verdeutlichen. Ausdrücklich sei davor gewarnt, nur aus färberischen Eigenschaften sonst unbekannte Strukturen zu deuten.

Allgemeine Regeln. Vor dem Gebrauche ist die betreffende Farbstofflösung stets zu filtrieren. Die aus einem Stückchen Filtrierpapier von 5 cm Seite bestehenden kleinen Trichter werden einfach durch zweimaliges Zusammenlegen hergestellt und in einen Korkrahmen gesteckt, den man sich durch Ausschneiden eines Stückes von ca. 2 cm Seite aus einer Korkplatte von ca. 5 cm Seite verfertigt hat. Der Korkrahmen wird auf vier lange Stecknadeln gestellt. Solche Trichter können viele Male benutzt werden; Trichter und Rahmen sollen nur für eine und dieselbe Flüssigkeit zur Anwendung kommen. Die in die Farbflüssigkeiten gebrachten Schnitte sollen nicht an der Oberfläche schwimmen; sie sind mit Nadeln in die Farbe unterzutauchen.

A. Kernfärbung.

a) von Schnitten und Häuten.

1. Mit Hansenschem Hämatoxylin (s. S. 7). Man filtriere 3-4 4 ccm der Farblösung in ein Uhrschälchen, dahin kommen

a) die Schnitte 1-5 Minuten,

werden dann b) in destill. Wasser abgespült 1-2 "

kommen dann c) in mehr (ca 30 ccm) destill. Wasser 5 Min. u. mehr

dann Einschließen in Xylolbalsam nach § 10,3 (S. 45).

Die Hauptsache ist bei der Hämatoxylinfärbung und bei vielen anderen Färbungen das ordentliche Auswaschen; ist das Wasser auch nur leicht blau geworden, so muß es durch neues ersetzt werden. Anfangs sehen die Schnitte ganz verwaschen blau aus; meist nach 5 Minuten, manchmal erst nach Stunden erfolgt die Differenzierung, die schon manche Details mit unbewaffnetem Auge erkennen läßt. Dabei geht die anfangs blaurote Farbe allmählich in schönes Dunkelblau über, das um so reiner wird, je länger (bis 24 Stunden) die Schnitte im Wasser liegen.

Die Zeit, in welcher sich die Schnitte färben, ist sehr verschieden. Schnitte in Alkohol fixierter und gehärteter Objekte färben sich in 1-3 Minuten. War die Fixierung mit Müllerscher Flüssigkeit oder mit Kalibichromat-Essigsäure erfolgt, so müssen die Schnitte etwas länger (bis 5 Minuten) in der Farbe bleiben. Anfängern ist zu empfehlen, die Schnitte verschieden lange Zeit, 1, 3, 5 Minuten in der Farbe zu belassen und dann zu kontrollieren, welche Zeitdauer zu einer gelungenen Färbung die passende ist.

Nach vollendeter Färbung wird die benützte Farblösung durch das Filter wieder in die Hämatoxylinflasche zurückgegossen. Das Uhrschälchen ist sofort zu reinigen.

Fehler-Korrektur. Ist ein Präparat zu stark gefärbt, so kann man das Hämatoxylin zum Teil wieder ausziehen; die zu dunklen Schnitte kommen dann

a) in ca. 5 ccm (Uhrschale voll) destilliertes Wasser + 2-3 Tropfen Essigsäure ca. 2 Minuten,

hier werden die Schnitte rot und heller,

dann b) in mehrmals zu wechselndes, reines, destilliertes Wasser ca. 5 Minuten,

hier wird die Essigsäure ausgewaschen, die roten Schnitte werden wieder blau. Schlecht ausgewaschene Schnitte verblassen nachträglich.

Kombination der Kernfärbung mit Gegenfärbung siehe G. S. 41.

Statt des Hansenschen Hämatoxylins möge auch P. Mayers Hämalaun (Hämatein pur. Grübler 0,5 g in 25 ccm 90%igem Alkohol durch Erwärmen gelöst und zusammengegossen mit einer Lösung von 25 g Alaun in 500 ccm destilliertem Wasser) empfohlen sein. Anwendung wie bei Hansens Hämatoxylin; man kann auch durchfärben (24 Stunden). Größere durchgefärbte Stücke müssen mit 1%iger Alaunlösung ausgewaschen werden.

2. Mit Anilinfarben. Aus der großen Reihe seien hierfür empfohlen: Vesuvin und Methylviolett B (S. 9). Man filtriere davon ca. 5 ccm in eine Uhrschale.

Dahin kommen a) die Schnitte 2-5 Minuten,

dann b) in 5 ccm destill. Wasser ¹/₂ Minute,

dann c) in 5 ccm Alk. absolut 3-5 Minuten,

hier werden die ganz dunklen Schnitte unter viel Farbenabgabe heller, so daß man einzelne Teile (z. B. bei Haut die Drüsen) schon mit unbewaffnetem Auge erkennen kann,

dann d) in neuen Alk. absolut ca. 2 Minuten,

dann Einschließen in Xylolbalsam nach § 10,3 (S. 45).

Der Effekt ist eine sehr schöne, dauerhafte Kernfärbung; der Nachteil liegt im starken Verbrauche von Alkohol absol.

Ähnlich wird Saffranin (S. 9) verwendet. Man filtriere davon ca. 5 ccm in eine Uhrschale.

Dahin kommen a) die Schnitte 24 Stunden,

dann b) in 5 ccm Alkohol 96% ¹/₂ Minute,

dann c) in 5 ccm Alkohol absol. und weiter wie bei Methylviolett B.

Man kann der Saffraninfärbung auch eine Ansäuerung vorausschicken, d. h. die Schnitte kommen a) in 10 ccm destill. Wasser + 1 Tropfen reine Salzsäure 5-10 Minuten,

dann b) zum Abspülen in reines, destilliertes Wasser ¹/₂ Minute,

dann c) (wie oben a) in die Farbe 24 Std. usw.

Zu langes Verweilen in dem absoluten Alkohol kann bis zu völliger Entfärbung der Schnitte führen. Mißlingen der Färbung beruht bei mit Chrom-Osmium-Essigsäure fixierten Objekten auf zu geringem Essigsäuregehalt dieser Fixationsflüssigkeit.

Kombination der Anilinkernfärbung siehe S. 41, G.

b) von Stücken vor Zerlegung dieser in Schnitte, sog. „Durchfärbung“.

3. Mit Boraxkarmin (S. 9). a) In 30 ccm dieser Farblösung kommen Stücke vorher fixierter und gehärteter Objekte,

a) wenn sie klein (5 mm Seite) sind 24 Stunden,

wenn sie größer sind 2-3 Tage,

dann b) direkt in 25 ccm salzsauren Alkohol (S. 9, ₄₂) 1-3 Tage,

dann c) in reinen Alkohol 90% 24 Stunden,

dann d) zum Nachhärten in Alkohol 96% 24 Stunden und mehr.

Der gebrauchte Boraxkarmin wird wieder in die Flasche zurückgegossen.

Beim Differenzieren in salzsaurem Alkohol wird der Alkohol nach wenigen Minuten rot — nur in Chromsalzlösungen (z. B. in Müllerscher Flüssigkeit fixierte Objekte) geben oft wenig Farbe ab — und muß nun durch neuen salzsauren Alkohol ersetzt werden; nach etwa ¹/₄ Stunde wird der Alkohol abermals gewechselt; dieser Wechsel wird so oft wiederholt, bis der Alkohol nicht mehr gefärbt ist. Das kann 1-3 Tage in Anspruch nehmen; während des ersten Tages wechsle man alle 2, während der folgenden Zeit alle 4 Stunden. Wenn man sparsam sein will, kann man mit einer Nadel das Objekt aus dem roten Flüssigkeitshof, in dem es liegt, langsam hinausschieben und an eine andere ungefärbte Stelle der Flüssigkeit bringen.

4. Mit Parakarmin (S. 9). Die Stücke (bis zu 3 cm Seite) kommen

a) in 30 ccm dieser Farblösung 24 Stunden,

dann b) in reinen (nicht salzsauren) Alkohol 70% 24 "

dann c) in Alkohol 90% 24 "

dann d) zum Nachhärten in 96% 24 " und mehr.

Färbt sich der 70%ige Alkohol stark, dann muß er durch neuen ersetzt werden. Der Vorteil des Parakarmins liegt im leichten Eindringen, in der Ausschaltung der Salzsäure und der Tatsache, daß nicht nur Kerne, sondern auch in leichtem Tone Zytoplasma gefärbt wird.

Fehler-Korrektur. Bei Überfärbung kommen die Stücke (bzw. die Schnitte)

a) in 40 ccm Alkohol 70% + 1 ccm Eisessig — 12 Stunden,

dann b) in reinen Alkohol 90% 24 " usw.

Kombination mit anderen Färbungen siehe S. 41, G.

B. Schleimfärbung.

5. Mit Delafields Hämatoxylin (S. 8).

Am besten eignen sich hierzu Schnitte von Objekten, die in Alkohol-Formol, Chromosmium-Essigsäure, Zenkerscher oder Müllerscher Flüssigkeit fixiert und in allmählich verstärktem Alkohol gehärtet worden waren.

Die Schnitte kommen

a) in 3 Tropfen der filtrierten Farbe + 25 ccm dest. Wasser 2-3 Stunden,

b) dann in Aq. destill. 1 Minute,

dann Einschließen in Xylolbalsam nach § 10,3 (S. 45).

Zuweilen müssen die Schnitte auch länger in der dünnen Farblösung verbleiben. Man kann den Fortschritt der Färbung mit schwacher Vergrößerung ohne Deckglas verfolgen. Auch die Kerne färben sich blau und ganz intensiv der Knorpel.

Kombination mit anderen Färbungen siehe S. 41, G.

C. Färbung elastischer Fasern.

6. Mit Resorzin-Fuchsin (S. 9).

Hierzu eignen sich am besten Schnitte von Objekten, die in Sublimatlösungen oder in Alkohol fixiert und gehärtet worden waren.

Die Schnitte kommen

a) in 5 ccm der Farbmischung 18-24 Stunden,

dann b) in 5 ccm Alkohol absol. 1 Minute,

dann c) in neuen Alkohol absol. 2-5 Minuten,

dann Einschließen in Xylolbalsam nach § 10,3 (S. 45).

Die Fasern erscheinen dunkelblau auf hellem Grunde.

Man kann die Färbung auch beschleunigen, indem man die offene Resorzin-Schale in den Thermostaten bringt, wo nach 2 Stunden die Färbung erfolgt. Ältere Farblösungen färben oft ungenügend. Um die gleichzeitige Blaufärbung von Knorpel und Schleim zu verhindern, ist empfohlen worden, zu a) 3 Tropfen Liq. ferri sesquichlor. zuzusetzen, allein solche Präparate verblassen bald.

Man kann die Färbung mit Kernfärbungen kombinieren. Die Schnitte kommen

a) in 10 ccm Boraxkarmin 24 Stunden,

dann b) zum Abspülen in reinen Alkohol 70% 10 Sekunden,

dann c) in Resorzin-Fuchsin nach Vorschrift.

Die freie Säure des letzteren besorgt die Differenzierung. Kombination mit Gegenfärbung siehe G. 15 (S. 42).

D. Färbung der Nervenelemente.

7. Mit Methylenblau.

Die Objekte, Zupfpräparate, Häute usw. werden möglichst frisch auf einen Objektträger gebracht und mit ein paar Tropfen einer ¹/₈prozentigen Methylenblaulösung (4 ccm der 1% Lösung (S. 9, 51) + 24 ccm 0,65%iger Kochsalzlösung) bedeckt und in zugedeckter Glasschale gestellt

a) in einen auf 36-37 °C geheizten Wärmeschrank. 1-1¹/₂ Stunden

Alle 10-15 Minuten müssen die Präparate unter dem Mikroskop kontrolliert werden, um den Verlauf der Färbung zu verfolgen, denn das Erfassen des richtigen Momentes der maximalen Färbung der Präparate und deren rechtzeitige Fixierung ist für das Gelingen sehr wesentlich. Bei der Kontrolle müssen neue Tropfen der Methylenblaulösung zugesetzt werden, sobald die Oberfläche der Präparate nicht genügend feucht erscheint.

dann wird der Objektträger mit dem Präparat zur Fixierung gelegt in b) große Mengen (40 ccm) 7%iges molybdänsaures Ammonium (S. 9, 52) 18-20 Stunden

hier lösen sich die Objekte vom Objektträger ab, dann c) in Aq. destill. 3-6 "

von hier aus werden die Objekte auf den Objektträger gebracht, wo Falten und dergl. mit der Nadel ausgeglichen werden und auf dem Objektträger (nach § 10,3, S. 45) in Xylolbalsam eingeschlossen.

8. Golgis schwarze Reaktion (färbt außer Nervenelementen auch die Sekretwege).

Die Methode vereinigt Fixieren und Färben. Die Objekte müssen möglichst frisch sein, ihr Durchmesser soll im allgemeinen 4 mm nicht überschreiten. Es ist aber nicht leicht, frische Gehirnstückchen u. a. von dieser Größe zu schneiden, ohne das zarte Gewebe zu quetschen, man lege deshalb zuerst größere (1-2 cm große) Stückchen in ein Schälchen mit frisch zubereiteter Golgischer Mischung (S. 5), welches zugedeckt und im Dunkeln (im Winter in einem auf ca. 25° C geheizten Wärmeschrank) aufgehoben wird. Nach 1-2 Stunden lassen sich die Stückchen leicht in Scheiben von ca. 4 mm Durchmesser zerschneiden. Die Menge der Golgischen Flüssigkeit richtet sich nach der Zahl der Scheiben, jede Scheibe beansprucht etwa 10 ccm der Mischung. Nach 2-6, seltener bis 15 Tagen (siehe darüber die speziellen Vorschriften) werden die Scheiben herausgenommen, rasch ein paar Sekunden mit destilliertem Wasser abgespült, leicht auf Filtrierpapier abgetrocknet und in 0,75%ige Silberlösung (30 ccm der 1%igen Lösung [24, S. 6] + 10 ccm destilliertes Wasser, für jedes Stückchen ca. 10 ccm der Mischung) gelegt. Die gebrauchte Golgimischung gieße man weg. Metallinstrumente sind bei der Silberlösung zu vermeiden. Sofort bildet sich um die Stückchen ein brauner Niederschlag. Für den Aufenthalt in der Silberlösung, die nicht im Dunkeln zu stehen braucht und nicht in den Wärmeschrank gestellt werden darf, genügen 2 Tage, die Stückchen können aber auch ohne Schaden bis zu 6 Tagen darin verweilen; ist die Schwärzung gelungen, was durch Probeschnitte festgestellt werden kann, kommen die Stückchen in Alkohol, werden dann in Hollundermark (oder in Zelloidin) eingebettet und in dicke Schnitte zerlegt (S. 19 ff.).

Jeder Schnitt wird sofort ohne Deckglas mit schwacher Vergrößerung auf seine Brauchbarkeit geprüft und, wenn tauglich, in ein Uhrschälchen mit Alkoh. abs. 1-2 Minuten, von da einige Minuten in Karbol-Xylol und dann auf einen Objektträger gebracht. Durch leichtes Aufdrücken von reinem Filtrierpapier auf den Schnitt entferne man das Xylol und füge einige Tropfen von Xylolbalsam zu dem Präparat. Ein Deckglas darf nicht aufgelegt werden, weil dadurch die im Präparat befindliche Feuchtigkeit nicht verdunsten kann und diese die Golgischen Präparate zerstört. Nicht selten — besonders wenn das Xylol nicht genügend entfernt worden war — zieht sich allmählich der Xylolbalsam von den Präparaten zurück; dieselben scheinen dadurch verdorben, lassen sich aber durch Aufsetzen eines neuen Tropfens Xylolbalsam wieder völlig herstellen. Man betrachte zuerst mit schwacher Vergrößerung; wenn der Balsam trocken geworden ist, kann man auch starke Vergrößerungen anwenden.

Die mit dieser Methode erzielten Resultate sind, wenn sie gelungen, ganz vorzügliche; einzelne (nie alle) Elemente des Nervensystems, aber auch zuweilen Blut- und Lymphgefäße, Fasern bindegewebiger Abkunft, Sekrete, Muskelfasern, Epithelzellen treten in voller Schärfe schwarz auf hellem Untergrunde hervor. Aber die Methode ist auch mit verschiedenen Mißständen verknüpft. So sind fast regelmäßig selbst die besten Schnitte durch schwarze Niederschläge verunstaltet; diese befinden sich vorzugsweise an den Rändern des Präparates; man hat, um sie zu vermeiden, vorgeschlagen, auf die frischen Objekte eine Schicht geronnenen Blutes zu streichen. Sehr häufig versagt die Reaktion überhaupt (besonders wenn die Golgische Mischung zu lange eingewirkt hat); dann führt die sogenannte „doppelte Methode“ zum Ziel, d. h. die Objekte werden, wenn die aus der Silberlösung genommenen Stücke an den ersten Schnitten nichts zeigen, abermals auf 26-36 Stunden in die Golgische Mischung und ebensolang in die Silberlösung gebracht. Bei abermaligem Mißerfolg ist zuweilen eine zweite Wiederholung der Prozedur von Erfolg gekrönt. Übung und Geduld sind bei der Anwendung der Golgischen Methode wichtige Faktoren.

Statt der kostspieligen Golgimischung ist für Nervenelemente und für Sekretwege zu verwenden auch Kalibichromatformol (S. 5) 50 ccm;

dahin kommen Stücke von ca. 2 cm Seite (nicht in den Wärmeschrank) 24 Stunden,

dann in reine 3¹/₂%ige Kalibichromatlösung 3-6 Tage.

Von da ab Silberbehandlung wie nach Einwirkung der Golgimischung. Auch an 48 Stunden altem Material gelingt hier noch die Imprägnation.

Auf beiderlei Weise geschwärzte Präparate lassen sich noch weiter fixieren und mit anderen Farbstoffen färben. Zu diesem Zwecke werden die Schnitte aus dem Alkohol in eine Mischung von 100 ccm 0,65%iger Kochsalzlösung (S. 3) + 200 ccm 96%igem Alkohol (diese großen Mengen sind unumgänglich nötig) auf 10-15 Minuten eingelegt und während dieser Zeit häufig mit einem Glasstabe umgerührt; dann kommen die Schnitte in eine mit ca. 20 ccm 80%igem Alkohol gefüllte Glasschale, die auf weißem Untergrunde im hellen Zimmer (nicht im Sonnenlicht) einen halben Tag stehen bleibt. Dadurch werden die schwarzen Niederschläge, die beim Einlegen in die Kochsalz-Alkoholmischung sehr schnell blaßgelb geworden waren, wieder dunkel. Nun färbe man mit Parakarmin (S. 34, ¹/₂ Minute) oder Delafields Hämatoxylin (S. 35). So fixierte und gefärbte Präparate können auch mit einem Deckglas bedeckt und nach § 10,3 in Xylolbalsam konserviert werden.

9. Ramon y Cajals Modifikation zur Darstellung der Nervenfibrillen. Kleine (ca. 1 cm) Stückchen ganz frischen Rückenmarks neugeborener Tiere kommen

a) in einem auf 25-30° C geheizten Wärmeofen in 1-3% wässerige Lösung von Argentum nitr. 4-7 Tage,

dann b) zum Abspülen in destilliertes Wasser ¹/₂ Minute,

dann c) in 100 ccm Aq. dest. + 5-15 ccm Formol (S. 8) + 1 g Pyrogallussäure 24 Stunden,

dann d) in dest. Wasser 2-3 Minuten,

dann e) zur Schnellhärtung in Alkohol 40% 1 Stunde,

dann f) in Alkohol 50%, 60%, 70%, 90%, 96% je 1 "

Die Pyrogallussäure ist in Apotheken käuflich; verursacht eine starke Gelbfärbung der Präparate; nimmt man anstatt dieser Säure das gleiche Quantum Hydrochinon, so wird der Grundton grau.

Dann bette man die Stückchen in weiches Paraffin oder Zelloidin (siehe Anhang) ein und fertige mit dem Mikrotom möglichst dünne Schnitte an. Statt des Rückenmarks kann man auch Gehirn nehmen. Junge Tiere sind älteren vorzuziehen; nicht ganz frische Stücke (z. B. beim Menschen) fixiere man statt mit 3%iger mit 6%iger Silberlösung.

Gute Resultate habe ich auch mit der von London (Arch. f. mikr. Anat. Bd. LXVI) angegebenen Methode erzielt. Vgl. ferner Bielschowsky (Journ. f. Psychologie Bd. III und Müller-Dahl (Deutsch. Arch. f. klin. Med. Bd. XCIX. S. 57).

10. Vergolden. Zur Darstellung von Nervenendigungen.

Stahlinstrumente dürfen nicht in die Goldlösung getaucht werden; alle Manipulationen in der Goldlösung sind mit Glasnadeln oder Holzstäbchen vorzunehmen.

Man erhitze in einem Reagenzgläschen 8 ccm der 1% Goldchloridlösung + 2 ccm Ameisensäure bis zum Sieden. Die Mischung muß dreimal aufwallen. Sehr kleine Stückchen (von höchstens 5 mm Seite) kommen

a) in die erkaltete, im Dunkeln stehende Mischung 1 Stunde,

dann b) in 5 ccm dest. Wasser zum Abspülen ¹/₂ Minute,

dann c) in 10 ccm Ameisensäure + 40 ccm dest. Wasser 12-48 Stunden.

In dieser Mischung werden die Stückchen dem Lichte (es bedarf nicht des Sonnenlichtes) ausgesetzt. Die Reduktion (die Stückchen werden dabei außen dunkelviolett) erfolgt sehr langsam, dann werden die Stücke nach Härtung in allmählich verstärktem Alkohol (S. 17) in 90%igen Alkohol übertragen, woselbst sie zur Verhinderung weiterer Reduktion im Dunkeln mindestens 8 Tage bis zur definitiven Verarbeitung (Freihandschnitte) verbleiben müssen.

Nervenfibrillen werden auch dargestellt durch

11. Studničkas Modifikation der Methode Bielschowskys, welche im wesentlichen Fibrillen des Bindegewebes, des Knochengewebes und anderes färbt.

In Formol 48 Stunden fixierte, dann in Alkohol gehärtete (S. 14, 2) (bei Knochen nach § 6 entkalkte) Objekte werden in Zelloidin (siehe Anhang) eingebettet und möglichst dünn geschnitten. Die Schnitte kommen

a) in Alkohol absol. 10 Minuten

dann b) in Alkohol 90% 10 "

c) in mehrmals zu wechselndes dest. Wasser (gut auswaschen) 10 Stunden,

d) in 3%ige wässerige Lösung von Argent. nitr. 4 Tage, (ins Dunkle stellen)

Von jetzt ab wird mit gebogenen Glasnadeln gearbeitet.

e) in destill. Wasser ein paar Sekunden

f) in 90 ccm ammoniakalische Silberlösung (S. 6, 25) ca. 15 Minuten,

g) in destill. Wasser 2 Sekunden,

h) in ca. 60 ccm 10%ige Formollösung (S. 14, 2) 5 Minuten,

so lange noch weißliche Wolken von den Schnitten aufsteigen.

Hier werden die Schnitte sofort tief dunkel.

i) in destill. Wasser ein paar Sekunden

k) in ca. 50 ccm ¹/₂%ige Goldchloridlösung ca. 3 Minuten

l) direkt in 50 ccm Fixiernatron ein paar Minuten

m) in Brunnenwasser ca. ¹/₂ Stunde

(wenn man kein fließendes Wasser benutzt, ist das Wasser zweimal zu wechseln).

Dann Einschließen in Xylolbalsam nach § 10,3 (S. 45).

Bei all diesen Manipulationen ist größte Reinlichkeit nötig. Behandelt man, wie gewöhnlich, viele Schnitte, so müssen die Nadeln bei jeder wiederholten Übertragung dazwischen gereinigt werden. Hat man z. B. einen Schnitt aus f) durch g) in h) gebracht, so darf die Glasnadel nicht wieder direkt in f) getaucht werden, sondern muß erst durch Eintauchen in destill. Wasser und durch Abtrocknen mit einem reinen Tuch gesäubert werden.

Nachfärben mit Parakarmin (¹/₂ Minute) oder Pikrofuchsin (3 Minuten) möglich.

Die Markscheidenfärbungen s. spez. Technik Rückenmark Nr. 97.

E. Färbung von Zellgrenzen und Kittsubstanz.

12. Versilbern.

Querstreifen, die bei Behandlung mit Silbernitrat in den verschiedensten Gewebselementen und Organen, besonders an Nervenfasern, Blutgefäßen, an Knorpel usw. auftreten, sind Kunstprodukte, die dort erscheinen, wo kolloide Gebilde unter Einwirkung von Silbernitrat, besonders unter gleichzeitiger Säurewirkung erstarren.

Der Gebrauch von Metallinstrumenten ist zu vermeiden, man bediene sich der Glasstäbe; statt Stecknadeln nehme man Igelstacheln.

Das Objekt wird in 10-12 ccm der 1%igen oder schwächeren (s. die speziellen Angaben) Lösung von Argent. nitric. (s. S. 6, 24) getaucht, nach ¹/₂-10 Minuten (je nach der Dicke des Objektes) aus der Flüssigkeit, die sich unterdessen meist milchig getrübt hat, mit Glasstäben (nicht mit Stahlinstrumenten) wieder herausgenommen, abgespült und in einer großen weißen Schale (einem Porzellanteller) mit ca. 100 ccm destilliertem Wasser dem direkten Sonnenlicht ausgesetzt; nach wenigen Minuten wird eine leichte Bräunung eintreten, das Zeichen der gelungenen Reduktion. Sobald das Objekt dunkelrotbraun geworden ist (gewöhnlich nach 5-10 Minuten), wird es herausgenommen, in ein Uhrschälchen mit destilliertem Wasser, dem ein paar Körner Kochsalz beigefügt sind,

gebracht 5-10 Minuten,

dann in ca. 30 ccm 70%igem Alkohol (im Dunkeln) 3-10 Stunden,

dann in Alkohol 90% 3-10 "

dann Einschließen nach § 10,3 (S. 45).

Das Einlegen in die Silberlösung muß unter Ausschluß des Sonnenlichtes geschehen, die Reduktion dagegen soll nur bei Sonnenlicht vorgenommen werden. Die Reduktion erfolgt zwar auch bei gewöhnlichem Tageslicht, aber nur langsam und liefert dann weniger scharfe Bilder. Scheint keine Sonne, so hebt man das aus der Silberlösung genommene und in destilliertem Wasser kurz abgewaschene Objekt im Dunkeln in ca. 30 ccm 70%igem (später 90%igem) Alkohol auf, um es in diesem beim ersten Sonnenblicke dem Lichte auszusetzen.

F. Färbung von Zentralkörpern, Kittleisten und Drüsengranula.

13. Heidenhains Hämatoxylin-Eisenlackfärbung.

Die Objekte müssen in Sublimat (am besten) (S. 16) oder in Zenkerscher (S. 16) oder in Flemmingscher Flüssigkeit (S. 17), (für Granula am besten in Alkohol-Formol oder in Kalibichromat-Formol [S. 15]) fixiert, die Schnitte sehr dünn sein, sind also nach Paraffineinbettung mit dem Mikrotom anzufertigen und auf einem Objektträger aufzukleben. Der Objektträger kommt aus dem absoluten Alkohol zur Beize

a) in eine Schale mit ca. 50 ccm Eisenlösung (S. 6, 18) 6-12 Stunden,

dann b) in destill. Wasser zum Abspülen ein paar Sekunden

dann c) in eine Mischung von 30 ccm Weigertschem Hämatoxylin und 30 ccm destill. Wasser 12-36 Stunden.

Das so verdünnte Hämatoxylin kann immer wieder zur Eisenlackfärbung gebraucht werden. Man sammle es in einer besonderen Flasche. Altes Weigertsches Hämatoxylin ist frisch bereitetem vorzuziehen.

Dann wird der Objektträger mit den undurchsichtig schwarz gewordenen Schnitten mit Brunnenwasser gut abgespült und in die obige Eisenlösung zur Entfärbung und Differenzierung zurückgebracht. Nach einiger Zeit (eine genaue Zeitangabe ist hier nicht möglich, man unterbreche die Färbung öfter, spüle die Objektträger mit Brunnenwasser kurz ab und untersuche ohne Deckglas mit starken Vergrößerungen, ob der Zweck der Färbung erreicht ist), spüle man den Objektträger ca. 15 Minuten (nicht länger) in womöglich fließendem Wasser (auf jeden Fall in Brunnenwasser) ab; dann Einschließen in Xylolbalsam nach § 10,3 (S. 45).

Die treffliche Methode gelingt leicht, sobald die Entfärbung langsam und sorgfältig vorgenommen wird. Ihr Nachteil liegt in der Willkürlichkeit der Färbung, indem bei zu langer Differenzierung die Farbe allmählich völlig ausgezogen wird. Nachfärbung mit Eosin, Pikrofuchsin möglich (G.).

G. Färbungen des Zytoplasma und der Grundsubstanzen — „Gegenfärbungen“.

Es handelt sich hier in der Regel um Färbungen, die mit anderen — in der Regel Kern- — Färbungen kombiniert, angewendet werden.

14. Eosinfärbung.

Schnelle Färbung. Die Schnitte kommen

a) in ca. 4 ccm (Uhrschale) destill. Wasser + ca. 10 Tropfen der Eosinlösung (46, S. 9) 1-3 Minuten,

dann b) zum Abspülen in destill. Wasser ¹/₂ Minute,

dann c) in destill. Wasser (ca. 30 ccm) 2-10 Minuten.

Langsame Färbung (ist besser). Die Schnitte kommen

a) in 10 ccm destill. Wasser + 3-4 Tropfen Eosinlösung (46, S. 9) 12-24 Stunden,

dann b) zum Abspülen in destill. Wasser ca. ¹/₂ Minute,

dann c) in reines destill. Wasser ca. 2 Minuten,

dann Einschließen in Xylolbalsam nach § 10,3 (S. 45).

Diese Färbung wird in der Regel, kombiniert mit der Hämatoxylinfärbung, die zuerst vorgenommen wird, in der Weise angewendet, daß die Schnitte dann aus dem Wasser in die Eosinlösung kommen.

15. Orangefärbung. Die Schnitte kommen

a) in ca. 2-4 Tropfen der Farbe (S. 9, 47) + 10 ccm 96% Alkohol 12-24 Stunden,

dann b) in Alkohol abs. 1-5 Minuten,

dann Einschließen in Xylolbalsam nach § 10,3 (S. 45).

Diese Färbung wird mit Vorteil bei der Färbung elastischer Fasern (C. 6, S. 35) nach der Boraxkarmin-Kernfärbung oder auch nach Hämatoxylinfärbungen angewendet.

16. Bleu de Lyon-Färbung. Die Schnitte kommen

a) in 10 ccm absolut. Alkohol + 1 ccm der Stammlösung (S. 9) 12 Stunden,

dann b) in absol. Alkohol 1 Minute,

dann Einschließen in Xylolbalsam nach § 10,3 (S. 45).

Wird mit Vorteil als Gegenfärbung nach Karmin- und Saffraninfärbungen angewendet. Bleu de Lyon färbt sehr scharf Bindegewebe, Knochen, aber auch Grenzen der Epithelzellen.

17. Pikrinsäure-Färbung. Gesättigte Stammlösung. 1 g Pikrin + 15 ccm Alkohol absol. Die Schnitte kommen

a) in eine Uhrschale (5 ccm) Alkohol absol. + 5 Tropfen der Stammlösung 1 Minute,

dann b) in reinen absol. Alkohol ¹/₂ Minute,

Längerer Aufenthalt in absol. Alkohol kann die gelbe Farbe völlig ausziehen. dann Einschließen in Xylolbalsam nach § 10,3 (S. 45).

Wird mit Vorteil kombiniert mit Kernfärbungen, und zwar nach diesen angewendet.

(Über die Pikrokarminfärbung siehe S. 47.)

18. Pikrofuchsin-Färbung (van Gieson).

Die mit Hansens Hämatoxylin überfärbten (30 Minuten) Schnitte kommen aus dem destill. Wasser

a) in 5 ccm Pikrofuchsin (Nr. 54, S. 9) 1-3 Minuten,

b) in 5 ccm destilliertes Wasser 10-30 Sekunden,

c) in 5 ccm Alkohol 90% 1 Minute,

dann Einschluß in Xylolbalsam nach § 10,3 (S. 45).

Der beim Einschluß nach § 10,3 nötige Aufenthalt in absol. Alkohol darf hier höchstens 2 Minuten dauern.

Resultat: Bindegewebe leuchtend rot, elastisches Gewebe, Muskelfasern gelb, Epithel und Kerne braun.

Die Methode ist nur bei feinen Schnitten anzuwenden und gelingt am besten nach Alkohol- oder Sublimatfixation, weniger, aber auch noch genügend, nach Fixierung in Lösungen, die Chromsäure bzw. ihre Salze enthalten. Auch ist die Haltbarkeit der Färbung eine beschränkte. Letzterem Mißstande kann man durch Ansäuerung (Einlegen der Schnitte vor a) und nach b) in 5 ccm salzsaurem Alkohol [S. 9, 42] auf je eine Minute) entgegenwirken.

19. „Dreifachfärbung“. Die Schnitte werden in Delafield-Hämatoxylin gefärbt (5, S. 35), kommen aus dem Wasser

a) in Saffranin (S. 9) 5 Minuten,

dann b) in Alkohol abs. 5 "

dann c) in neuen Alkohol absol. 5 "

dann d) in neuen Alkohol absol. 5 "

dann e) in den verdünnten Pikrinalkohol (17a, S. 42) 1 Minute,

dann f) in reinen Alkohol absol. ¹/₂ "

dann Einschluß nach § 10,3 (S. 45).

Resultat: Schleim blau, Kerne rot, Protoplasma, Fasern gelb. Besonders schön nach Fixierung mit Chrom-Osmium-Essigsäure.

§ 9. Injizieren.

Das Füllen der Blut- und Lymphgefäße mit farbigen Massen ist eine besondere Kunst, die nur durch sehr viel Übung erworben werden kann. Die Kenntnis der vielen kleinen, hier zur Anwendung gelangenden Kunstgriffe läßt sich kaum durch die Lektüre selbst in aller Breite gegebener Anweisungen aneignen. Hier ist der praktische Unterricht unerläßlich. Dementsprechend glaube ich in dem für Anfänger bestimmten Buche auf die Angabe einer ausführlichen Injektionstechnik verzichten zu müssen.

Wer sich im Injizieren versuchen will, muß eine gut schließende, mit leicht beweglichem Stempel versehene Spritze und Kanülen von verschiedener Dicke haben. Als Injektionsmasse empfehle ich: Berlinerblau von Hollborn (Adr. S. 3) 3 g in 600 ccm destilliertem Wasser gelöst.

(Siehe auch Tandler, Zeitschrift für wissenschaftl. Mikroskopie Bd. XVIII. 1901. S. 22.)

Man beginne mit der Injektion einzelner Organe, z. B. der Leber, welche den Vorzug hat, daß selbst eine unvollkommene Füllung ihrer Gefäße noch brauchbare Resultate ergibt. Das injizierte Objekt fixiere man 2-4 Wochen in Müllerscher Flüssigkeit (S. 15) und härte es in allmählich verstärktem Alkohol (S. 17). Die Schnitte dürfen nicht zu dünn sein. Für Lymphgefäß-Injektion ist chinesische Tusche (siehe Lendorf, Anatom. Hefte Bd. 17, S. 370) und die Methode von Polano (Deutsche med. Wochenschrift 1902, Nr. 27) zu empfehlen.

§ 10. Einschließen und Konservieren der Präparate.

Die fertigen Schnitte usw. werden nun zur mikroskopischen Untersuchung auf einen Objektträger übertragen und mit einem Deckglase bedeckt. Die Medien, in welchen sich die Schnitte befinden, sind entweder 1. Wasser, oder, wenn man die Schnitte aufhellen und konservieren will, 2. Glyzerin oder 3. Xylolbalsam.

Das Übertragen auf den Objektträger geschieht so, daß man in der Regel zuerst einen kleinen Tropfen der betreffenden Flüssigkeit auf die Mitte des Objektträgers bringt; dann fängt man mit dem Spatel den Schnitt auf und zieht ihn von da mit der Nadel auf den Objektträger. Sehr feine Schnitte werden besser mit der Spitze eines Glasstabes aufgefangen und durch Rollen desselben auf den Objektträger gebracht. Liegt der Schnitt glatt auf, so bedeckt man ihn mit einem Deckglase.

Untersuchungen mit schwachen Vergrößerungen ohne Deckglas sind nur zu alleroberflächlichster Orientierung, ob z. B. ein Objekt hinreichend zerzupft ist, zulässig. In allen anderen Fällen ist das Deckglas unentbehrlich. Um sich davon zu überzeugen, betrachte man einen unbedeckten Schnitt, decke ihn dann mit dem Deckglase zu und betrachte wieder. Manches gute Präparat, das man zu bedecken versäumt hat, erscheint unbrauchbar. Untersuchungen mit starken Objektiven (Nr. 7) ohne Deckglas sind im allgemeinen unzulässig; sie sollen nur bei einzelnen Methoden, z. B. der Golgischen, vorgenommen werden.

Das Deckglas muß an den Kanten, nicht an den Flächen angefaßt werden; beim Bedecken wird das Deckglas mit der linken Hand auf den Objektträger aufgesetzt und nun langsam auf das Präparat gesenkt, indem man die Deckglasunterfläche mit einer in der rechten Hand gehaltenen Nadel stützt. Einfacher ist es noch, an die Unterfläche des Deckglases einen Tropfen der betreffenden Flüssigkeit anzuhängen und dann das Deckglas sanft auf das Präparat fallen zu lassen. Die Flüssigkeit, in welcher sich der Schnitt usw. befindet, muß genau den ganzen Raum zwischen Deckglas und Objektträger ausfüllen. Ist nicht genug Flüssigkeit da (das ist an großen, unter dem Deckglas befindlichen Luftblasen kenntlich), so setze man mit der Spitze eines Glasstabes noch einen Tropfen der Flüssigkeit an den Rand des Deckglases. Ist zuviel Flüssigkeit da — und darin pflegt der Anfänger ganz Besonderes zu leisten —, so muß man die über den Rand des Deckglases hinausgetretene Flüssigkeit mit Filtrierpapier aufsaugen. Die Oberfläche des Deckglases muß stets trocken sein. Kleine Luftblasen unter dem Deckglase entferne man durch öfteres vorsichtiges Heben und Senken desselben mit der Nadel (s. ferner S. 47).