Bakteriologische Untersuchungen.

Die Untersuchungen der Fermentation und besonders das Suchen nach den Bakterien, die hierbei funktionieren, sind Untersuchungen, die viel Zeit kosten. Wenn wir bedenken, dass das Tabaksblatt nach der Entfaltung der Knospe der Luft ausgesetzt ist und immer die Einflüsse der Witterungszustände erfährt, wobei die an Bakterien reiche Luft dieselben oder die Sporen der Mikroorganismen auf dessen Oberfläche deponiert, wenn wir bedenken, dass der Staub in den Scheunen sehr reich ist an Mikroben, dann brauchen wir uns nicht mehr zu fragen, wie es kommt, dass beim Anlegen der bakteriologischen Kulturen so viele Arten von Organismen gefunden werden. Um zu einem Resultate zu gelangen, sind Hunderte von Kulturschälchen von mir angelegt worden und eben so viele Teilungs- oder Trennungskulturen um zu entscheiden, ob die Reinkulturen auch »rein« seien. Zuallererst suchte ich nach Hefen, doch diese Untersuchungen erwiesen sich bald als fruchtlos. Weder die sofort angestellten mikroskopischen Untersuchungen noch die Malzgelatine zeigten mir das Erscheinen von Hefenarten bei dieser Fermentation. Dann wurden Versuche mit der alkalischen Gelatine gemacht. Der ungebrühte Tabak wird in kleine Stücke geschnitten und in gut schliessenden gläsernen Schälchen zusammengepresst. Der also zubereitete und mit sterilem Wasser angefeuchtete Tabak wird mit einer Bleischeibe beschwert und mit einigen andern Schälchen in eine Glasglocke gebracht (fig. 4, D).

Fig. 4. Versuchsanordnungen, welche die Methode, um die Aëroben und Anaëroben zu züchten, angeben.

Ein andrer Teil des grob geschnittenen Tabaks wird in eine Glasglocke gebracht, deren oberer Teil hermetisch an den unteren Teil schliesst und deren Deckel obendrein noch mit einer gläsernen Röhre und einem Hahn mit der Aussenluft correspondiert. Auch dieser Tabak ist angefeuchtet und mittels einer Bleischeibe beschwert. Von einer Wasserstrahlluftpumpe, verbunden mit Manometer, wird die Luft herausgesogen und Wasserstoffgas hineingebracht. Dies wird einige Male wiederholt, um die Gewissheit zu erhalten, dass alle Luft ausgetrieben ist, schliesslich ist und bleibt die Glocke mit Wasserstoff angefüllt, damit die Anaëroben die Gelegenheit haben, sich zu entwickeln (fig. 4, A). Wie die Schälchen wird auch diese Glocke in einen Brutschrank bei 40° C. gestellt. Nach Verlauf einiger Tage ist am Geruch merkbar, dass die Gährung angefangen hat.

Die Aërobenkulturen werden wie gewöhnlich in Petri'schen Schälchen angelegt. Ein Wenig des gährenden Tabaks wird mit sterilen Instrumenten aus einem der Schälchen genommen, auf sterilem Papier feingeschnitten und in flüssige alkalische Gelatine gebracht. Die Stückchen werden tüchtig mit einer ausgeglühten Platinnadel abgerieben und gleichmässig durch Schwenken der Röhre in derselben verteilt. Um Verdünnungen von dieser Röhre zu machen, wird eine geringe Quantität dieser Gelatine mittels einer Platinspirale, die in diesem Falle 50 mgr. aufnimmt, in eine zweite Röhre hineingebracht, und hiervon nach guter Teilung eine oder mehr Spiralen in eine dritte Röhre u. s. w. Jede Röhre wird dann in ein Kulturschälchen ausgegossen. Nach einigen Tagen haben die Bakterien sichtbare Kolonien gebildet, mit denen man weitere Versuche anstellen kann.

Die Anlage der Anaërobenkulturen geschieht in anderer Weise, und zwar nach der Methode Liborius und Buchner.

Im ersten Falle wird wieder der fein geschnittene Tabak aus der mit Wasserstoff gefüllten Glocke in flüssige Gelatine gebracht und verteilt, und hiervon werden wieder die nämlichen Verdünnungen gemacht. In kaltem Wasser lässt man die Gelatine fest werden und nachher wird die ganze Röhre bis zum Wattepfropfen mit steriler Gelatine angefüllt (fig. 4, B).

Im zweiten Falle wird der Tabak aus der nämlichen Glocke in derselben Weise in die Gelatine-Röhre hineingebracht und werden gleichfalls Verdünnungen angelegt. Nachdem die Gelatine fest geworden ist, wird der Wattepfropfen fast bis zum Gelatine-niveau geschoben und nachdem der obere Teil der Röhre mit einem Diamanten abgeschnitten worden ist, wird diese kurze Röhre in eine weite Reagirröhre auf ein sich dort befindendes kleines Stück Metallgaze gebracht (fig. 4, C). In diese grosse Röhre ist unter das Drahtnetz, welches der Kulturröhre zum Ruhepunkt dient, 2 Gramm Pyrogallol gebracht. Wenn dies alles fertig ist, lässt man mit einer Pipette 10 cm³ von einer 1 % KOH-lösung in die weite Röhre hinein fliessen und schliesst dann sofort die Röhre mit einem gut schliessenden Kautschukstöpsel, der obendrein noch mit Paraffin umgeben wird.

Nach beiden Methoden gelangen die Anaëroben zum Wachstum und bilden, obgleich langsam, gut sichtbare Koloniën. Damit man hiervon Impfungen machen kann, wird die Gelatineröhre an denjenigen Stellen mit einem Diamanten durchschnitten, an denen man die Kolonien mit einer Nadel erreichen kann. Auch diese Impfungen, Strich- oder Stichkulturen, geschehen derartig, dass entweder durch das Aufgiessen von Gelatine oder in der genannten Weise mit alkalischer Pyrogallollösung die Anaëroben sich in dem sauerstofffreien Raum entwickeln können. Auf diese Weise habe ich eine Anzahl Versuche gemacht, und als sich ergab, dass die Anaëroben fakultative Anaëroben waren, wurden die Versuche mit der alkalischen Gelatine in Petri'schen Schälchen fortgesetzt. In der Zwischenzeit, im Winter von 96-97, wurde mir, wie beschrieben ist, durch chemische Analyse bekannt, welche Stoffe bei der Fermentation angegriffen wurden. Damals ist der Nährboden, wie folgt, von mir geändert worden:

alkalische Gelatine (Koch) 100

Kalium-nitrat 0.2

Asparagin 0.1

Glycerin 1.5

Glucose 0.5

Nicotin Spuren.

Auf diesem Boden entwickeln die Kolonien sich schneller und in grosser Menge. Ein Beweis, wie nützlich es ist, eine Untersuchung, welche ursprünglich nur die Gährung betraf, auf ein völliges Studium des Tabaks auszudehnen.

Bei der Untersuchung der Platten zeigen sich noch eine Menge Schwierigkeiten, welche zu Irrtum Veranlassung geben könnten. Sehr verführerisch scheinen die Verdünnungsplatten, auf denen sich 10 oder 20 Kolonien zeigen, die makroskopisch gleich aussehen und doch nicht bei der Gährung funktionieren: ich betrachte dieselben entweder als zufällige örtliche Verunreinigungen in dem gährenden Tabak, oder als Kolonien, welche durch Teilung einer Bakterienkette während der mechanischen Behandlung beim Anlegen der Kulturen entstehen. Im ersteren Falle finden sich doch im gährenden Tabak die Lebensbedingungen für eine bestimmte Bakterienart; es ist dort, dass sie örtlich zur Entwicklung und Vermehrung kommen.

Dergleichen Erscheinungen beim Anlegen der Kulturen erschweren die Untersuchungen. Auch später fand ich bei den Untersuchungen der lebenden Blätter, dass ihre Oberfläche durch das Wachstum bestimmter Bakterienarten eingenommen wird (Rhizobium Frank u. a.). Auch hier scheint also auf der Blattoberfläche der Kampf ums Dasein zu bestehen. Nicht selten gelang es mir, von den Blättern die nämlichen Arten zu isolieren. Der Gebrauch starker Verdünnungen ist bei Untersuchungen wie diese Hauptsache. Ein Quantum gährenden Tabaks, welches noch nicht die Oberfläche von einem Gulden einnahm, brachte in einzelnen Fällen tausende Kolonien zur Entwicklung. In einem zuerst angelegten Petri-Schälchen berechnete ich einmal 40.000 Kolonien, ein Beweis, dass Verdünnung das angezeigte Mittel ist, Ordnung in das Chaos zu bringen.

Von dem Tabak, welcher in den Schälchen und in der Glocke zum Gähren gebracht wurde, wurden einmal die Woche, neun Wochen lang, die Kulturen angelegt. Dadurch, dass eine grosse Menge Platten auf diese Weise untersucht wurden, war es nicht schwer, diejenigen Kolonien zu isolieren, welche schon in grosser Masse anwesend waren. Besonders in den ersten Wochen zeigten sie sich in wachsender Anzahl und verursachten deshalb nicht selten, dass die Platten ganz sich verflüssigten, ungeachtet der starken Verdünnungen, auf die man soviel Sorgfalt verwendet hatte. In derselben eben beschriebenen Weise wurden in Wageningen die Kulturen angelegt.

Fast nie fehlte der B. mycoides und der B. subtilis; beide sind streng aërobe Bakterien. Ersterer bildet NH₃ aus Eiweiss, doch lebt nur in O-haltigen Räumen, der zweite könnte gleichfalls bei der Gährung die Rolle spielen, dass er daran mitarbeitet dem Haufen die nötige Temperatur zu geben. Der B. subtilis, der nach Cohn die Brühung des Heus und des Stalldüngers verursacht, könnte gleichfalls in dem bereit stehenden Haufen den noch anwesenden freien O verbrauchen.

Wenn also in dieser Weise die Lebensbedingungen auch für die Anaëroben geschaffen werden, wird sich die Temperatur durch die biologischen Prozesse der Mikroben zu jener Höhe steigern, die im gährenden Haufen beobachtet wurde. Jedoch muss hier wieder bemerkt werden, dass immer fakultative Anaëroben aus den Kulturen von mir isoliert worden sind, die also zusammen mit dem Mycoides und Subtilis erst den Sauerstoff verbrauchen, um später getrennt von diesen letzeren Mikroben, welche streng aërob sind, ihre Lebensfunktionen fortzusetzen. Durch den Einfluss dieser fakultativen Anaëroben bekommt der Tabak sein Arom, insofern wir bei unserm holländischen Tabak davon reden können.

Bei der Fermentation haben wir also zu thun mit Zersetzungen, nicht hervorgerufen durch chemische Agentien, sondern durch einige Mikroorganismen. Dass die von mir isolierten Mikroben eine entschiedene Wirkung ausüben, stimmt mit meinen letzten Untersuchungen, die noch im Monat September des Jahres 1897 gemacht worden sind, überein. Alsdann ist es mir gelungen, als ich nach der Ursache der Mosaikkrankheit suchte, von der Epidermis der lebenden Blätter, Bakterien zu isolieren, welche denjenigen, die ich in grosser Zahl aus dem gährenden Haufen in Kultur brachte, völlig glichen. Sie fanden sich auf jenen Blättern nicht als latente Mikroben, als Sporen, sondern in vegetativen Formen als »Örtliche Kulturen«. Hierdurch auch zeigten meine Kulturplatten jenen Reichtum, nicht an Arten, sondern an »Reinkulturen«. Die Bakterien, die ich im Allgemeinen im gährenden Tabak fand, sind, ausser den genannten Mycoides und Subtilis, Mikroben, welche ich in »Flügges« System in die Gruppe der Subtilis und Proteus bringe.

In Figur 5, I-V sind deren Kulturen, in Gelatine, auf Agar und Kartoffel wiedergegeben, ebenso die Form der Bakterien und der Kolonien in den verschiedenen Stadien ihrer Entwicklung. Ich nenne die funktionierenden Bakterien: Bacillus Tabaci I, II, u. s. w.

Wie die Figur zeigt, haben die Gelatine-Stichkulturen Ia und IVc nebst VIa mit B. anthracis (zur Vergleichung) grosse Ähnlichkeit; gleichfalls die Kulturen auf Kartoffel von Ic und IIc, wobei erstere hell rosa und feinkörnig, letztere milchweiss und schwer gefaltet ist. Weiter zeigen die Strichkulturen auf Gelatine von IVb und Va Übereinkunft in den Ausläufern, welche federartig sind; bei IVb liegen sie auf der Gelatine und durchdringen dieselbe, bei Va liegen sie besonders regelmässig nur auf der Gelatine. Alle von I-V sind Stäbchen oder Bacillen. Von den Eigenschaften der Kulturen I, II und IV nenne ich die Bildung von NH₂ aus Eiweiss. Ebenso wie der B. Mycoides, ist der B. Tabaci I, II und IV im Stande, die Eiweisse, Peptone und den sterilen Tabak derartig zu zersetzen, dass NH₃ entsteht. — Es sind Aëroben. —

Fig. 5. (I-V) Reinkulturen der Bakterien, welche allgemein in gährendem Tabak angetroffen werden und wobei die B. T. I und III die Hauptrolle spielen. VI zur Vergleichung Bacillus anthracis.

Der B. Tabaci III bewirkt den neutralen Verlauf der Gährung; dabei wächst er anaërob, doch ist selbst eine fakultativ anaërobe Bakterie. Er besitzt jedoch unter ihren verwandten Formen »Eiweissfermente« und »Saprophyten der Fäulnis«; er bildet weiter 2 Sporen (?) in einem etwas gekrümmten Stäbchen (III), ist nicht beweglich, bildet kein Indol, macht Löfflersche Bouillon trübe, und bildet ein dünnes Häutchen an der Oberfläche. Er verflüssigt die Gelatine, giebt einen dünnen, matt ausgebreiteten Niederschlag auf Agar und eine rahmartige, dicke nicht gefaltete Kultur auf Kartoffel. Dieser B. Tabaci III muss in die Gruppe des Subtilis untergebracht werden.

Der B. T. IV gehört wie der B. T. I. zu der Gruppe des »Proteus« und ich betrachte sie als sehr nahe verwandt mit dem B. Proteus Zopfii.

Die Entstehung der Kolonien auf und in alkalischer Gelatine ist sehr eigentümlich. In der Figur ist IVe und IVg die Kolonie, welche an der Oberfläche, IVff dieselbe welche in Gelatine wächst.

Ursprünglich ist diese letztere hellblau von Farbe und geht allmählich in hellgrün über. Es besteht also in diesem Wachstum, mikroskopisch betrachtet, eine Ähnlichkeit mit dem B. Mycoides, jedoch bildet B. T. IV keine Sporen. Die Kolonie wächst anaërob sehr schwach.

Von der ursprünglich gebildeten Kolonie IVe strahlen Bakterienfäden in allen Richtungen aus. An bestimmten Punkten entstehen Tochterkolonien, welche wiederum Fäden aussenden, um neue Kolonien zu bilden, wie IVf, g zeigt. Auch bei B. anthracis wird bekanntlich eine derartige Erscheinung beobachtet, VIb.

Höchst wahrscheinlich spielt der verwandte B. Tabaci V auch eine Rolle bei der Gährung. In einer grossen Anzahl Platten habe ich ihn gefunden; auch er ist, ebenso wie B. T. IV, schwach anaërob und stimmt in vielen Eigenschaften mit diesem überein.

Das Wachstum der Kolonie in der Gelatine zeigt die nämliche Erscheinung wie beim B. T. IV. In Unmasse entstehen um die ursprünglich gebildete Kolonie Tochterkolonien, Vc. Durch eine chemotactische Wirkung des noch unverbrauchten Nährbodens entsteht die concentrische Anordnung der Tochterkolonien, die alle einem einzigen Bakterienfaden, der von der Mutterkolonie radial austritt, ihre Entstehung verdanken.

In groben Zügen ist dies die Beschreibung der Mikroben, welche die Gährung unseres Tabaks verursachen. Später komme ich hierauf ausführlich zurück.

Die Erscheinung, dass der Betuwer Tabak weniger NH₃ bildet, muss höchstwahrscheinlich der geringen Anwesenheit des B. T. I, II, IV oder V zugeschrieben werden, da der B. Mycoides allgemein verbreitet ist. Wenn der Betuwer Tabak künstlich mit B. T. I, II, IV oder V geimpft wird, entsteht im Anfange der Gährung reichlich NH₃.

Es zeigte sich in den Jahren 1894 und 96 (Tabak von 94 und 96), dass das Erd- und Sandgut nicht brühen wollte, während das Bestgut, welches zuletzt gepflückt worden war, sich nicht so hartnäckig erwies. Es muss hierfür eine Ursache vorhanden sein. Es fiel mir auf, als ich in den Monaten August und September des Jahres 1897 die lebenden Blätter untersuchte, dass der B. T. I, IV und V fast immer von mir gefunden wurden, während ich sie nicht auf den jungen Blättern im regnerischen Monat Juni fand.

Alle Bakterien, welche auf die Blätter fallen, kommen von der Erdoberfläche und werden durch Luftströme darauf gebracht. Im Anschluss an meine Untersuchungen der Luft, die ich früher mitgeteilt habe, ist die Luft am ärmsten an Keimen, wenn der Boden nass ist. Desshalb vermute ich, dass die regnerischen Sommer von 94 und 96 einen nicht geringen Anteil an dem trägen Verlauf der genannten Gährung gehabt haben. Die Tabakspflanzer und Fermentierer sollten künftighin darauf achten. Das Bestgut, welches länger der Luft ausgesetzt war, hat auch besser Gelegenheit gehabt, während der verschiedensten Witterungszustände mehr Bakterien auf seinen Blättern festzuhalten.

Hiermit am Ende dieser Arbeit, habe ich Veluwer Tabak von einer Sorte in gläsernen Schälchen sterilisiert, mit den Kulturen B. T. I, II, III, IV, I + II, I + III u. s. w. geimpft, mit einer Bleischeibe beschwert und langsam auf eine Temperatur von 40° C. gebracht. Die Gährung habe ich reichlich 6 Wochen ihren Verlauf nehmen lassen und dann gehemmt. Die Reaktion wurde stets kontrolliert und in Übereinstimmung gefunden mit dem, was schon beschrieben worden ist.

Dann habe ich unparteiisch diesen Tabak von erfahrenen Händlern und Züchtern beurteilen lassen, mit dem Erfolge, dass alle, nl. die Herren A. Herschel in Amersfoort, H. de Hartog und v. Druijnen in Wageningen, Gijsberts Jr., in Valburg und N. v. Os Fz. in Amerongen ohne Zaudern denjenigen Tabak erwählten, welcher geimpft war mit B. Tabaci I + III, während ein alter Arbeiter der Impfung mit B. T. IV den Vorzug gab und nach dieser gleichfalls die Impfung mit B. T. I + III als die beste angab.

Durch die Impfung mit der Reinkultur von Bacillus Tabaci I + III erhält der Tabak ein angenehmes, honigsüsses Aroma. Die Zukunft wird zeigen, wie die Gährung unseres Tabaks verlaufen wird, wenn ich diesen mit den Reinkulturen impfe, welche ich aus unserm indischen und dem Havanna-Tabak isolieren werde. Von der Versuchsstation in Buitenzorg erwarte ich eine Sendung ungebrühten Tabaks edler Arten, und dann hoffe ich später das Resultat dieser Untersuchungen mitzuteilen. Ebenso nehme ich mir vor, nicht-sterilisierten Tabak mit Reinkulturen zu impfen.