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Avant même de passer à la Réforme, sous le règne d'Henri II, il avait entrepris de fonder au Brésil une colonie, qui servirait au besoin d'asile aux protestants français persécutés. Ce premier établissement en territoire portugais n'eut pas de durée. L'Amiral reprit son projet en 1562, et il crut mieux réussir dans l'Amérique du Nord où les pêcheurs bretons exploitaient depuis longtemps les bancs de morues de Terre-Neuve488. Entre le Saint-Laurent, découvert par Jacques Cartier, et la Floride que revendiquait l'Espagne, s'étendaient d'immenses territoires sans maîtres; il y envoya successivement Jean Ribaut (1562-1563) et, après la paix d'Amboise, Laudonnière, qui bâtit au nord de la Floride le fort de la Caroline et commença le «peuplement». Mais Philippe ne voulait pas souffrir, comme le disait sa femme à l'ambassadeur de France, Saint-Sulpice, «que les François nichent si près de ses conquestes, mesme que ses flottes en allant et venant à la Neusve Espaigne, sont contraintes de passer devant eux». Catherine, que D. Francès de Alava questionnait sur cette expédition, répondit que Charles IX ne prétendait rien «en cest endroit que conserver une terre qui pieça a été descouverte et possédée par les François, comme le nom de la Terre aux Bretons le témoigne encore assez» (novembre 1565)489. Le 18 janvier 1566, il revint à la charge, la sommant de dire si le Roi son fils avait «commandez à ceux qui sont allez à la Floride faire ceste entreprise et aussi commerce et trafic par delà», elle riposta «que le commerce est libre entre les subjects des amis et que la mer n'est fermée à personne qui va et trafique de bonne foy» et que quant à «la Terre aux Bretons» nous l'«estimons nostre». «Qu'il se sousvint aussi, lui dit-elle, que les roys de France n'ont pas accostumé de se laisser menacer; que le mien (le Roi son fils) estoit bien jeune, mais non pas si peu connoissant ce qu'il est qu'il n'y ait tousjour plus affaire à le retenir qu'à le provoquer»490. Mais les Espagnols, avant que la Cour de France en sût rien, s'étaient fait raison. Philippe II avait envoyé 2 000 hommes commandés par Pedro Menéndez de Avilés, qui assaillirent traîtreusement et massacrèrent les soldats et les colons (octobre 1565). Catherine fit demander à Madrid justice ou réparation (mars 1566). Et comme la reine d'Espagne se plaignait du crédit de Coligny, Fourquevaux, l'ambassadeur de France, répliqua: «que la suffizance (capacité) dud. sr est telle, soit en Conseil et ailleurs, que s'il seroit ung Juyf ou un Turc, encore mériteroit-il estre estimé et favorizé: car mesme oultre le lieu qu'il tient d'admiral, qui est un des plus grandz estatz» du royaume, «il n'y a prince aujourd'uy ny seigneur plus digne de toute grande charge qu'il est»491.