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Jusque-là les rapports entre les deux Cours n'avaient pas été cordiaux, mais ce n'était pas la faute de Catherine. Elle avait, après la mort de François II, pressé Marie Stuart, à qui elle gardait rancune, de retourner en Écosse et elle l'y laissa aux prises avec ses sujets presbytériens, qui, soutenus par les forces anglaises, avaient imposé à la régente, Marie de Lorraine, sa mère, la reconnaissance de leur Église571. Quoique Élisabeth se fût pendant la première guerre civile, alliée à Condé et Coligny pour lui reprendre Calais, elle avait à deux reprises, quelques mois après le traité de Troyes, sollicité sa main pour Charles IX572. Il s'ensuivit de cette recherche, qu'Élisabeth finit par décliner (12 juin 1565), que les Anglais n'aidèrent plus aussi ouvertement les huguenots pendant les deux guerres qui suivirent et que Catherine, rompant décidément avec la politique d'Henri II et des Guise, abandonna la défense du catholicisme et, par suite, des intérêts français en Écosse. Marie Stuart, livrée à elle-même, avait réussi d'abord à calmer par ses ménagements l'opposition religieuse, mais elle la souleva plus ardente, en faisant ou laissant tuer Darnley, son mari, qui d'ailleurs l'avait outragée, et en épousant de gré ou de force l'un des meurtriers, Bothwen, que d'ailleurs elle ne détestait pas573. Évadée du château fort où les lords rebelles l'avaient enfermée et de nouveau vaincue, elle s'était enfuie en Angleterre pour chercher asile et appui auprès d'Élisabeth, sa cousine (15 mai 1568). Elle n'y trouva qu'une prison. La fille d'Henri VIII et d'Anne de Boleyn garda en son pouvoir cette suppliante, qui descendait comme elle d'Henri VII Tudor et que beaucoup de catholiques anglais, vu son hérésie et l'irrégularité de sa naissance, considéraient comme la légitime héritière de Marie Tudor. Contre tout droit, elle se constitua juge des accusations dont les Écossais chargeaient leur souveraine, et, inquiète du nombre et du zèle des défenseurs de Marie Stuart, elle resserra toujours plus étroitement sa captivité.